黄曲霉毒素控制的突破

文开新

许多既有应用前景又令人兴奋的技术正在不断地被推出，它们能够帮助人们应对作物的霉菌毒素污染问题，其中一个突破就是宿主诱导基因沉默技术。研究已证明了如何使用这项技术来减少收获前玉米中的黄曲霉毒素。

中图分类号：S852.4+4 文献标志码：C 文章编号：1001-0769（2018）05-0001-03

霉菌毒素是由各种真菌产生的有害于动物健康的化合物。据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）估计，全球大约1/4的食物至少会被一种霉菌毒素污染。依据对农业生产损失和动物健康影响来说，问题最为严重的霉菌毒素是黄曲霉毒素。黄曲霉毒素由多种曲霉菌（Aspergillus Fungus）产生。由于其会影响动物健康，许多国家在法律上对人的黄曲霉毒素的摄入量都进行了规定，美国对食物中黄曲霉毒素含量的限定最为严格，要求不得超过20 μg/kg，而欧盟对婴儿奶粉中黄曲霉毒素的含量要求不得高于0.025 μg/kg。

数十年来，对于如何降低食品/饲料中黄曲霉毒素含量的问题，商业界和学术界进行了多方面的研究。这些研究包括用不产霉菌毒素的曲霉菌来竞争天然产毒的曲霉菌、在易感作物中培育抗真菌或抗霉菌毒素的品种、使用螯合剂结合霉菌毒素来使其失去生物学活性。尽管人们做了很多努力，但是，据估计每年各类作物因黄曲霉毒素含量超标就要损失数百万吨，这其中以玉米为主。

1 降低玉米中黄曲霉毒素的含量

玉米在全球范围被大量用于食物/饲料，而且很容易被黄曲霉毒素污染。据估计全球每年约有50亿人食用玉米，且主要集中在发展中国家，人们因食用受到霉菌毒素污染的玉米而导致霉菌毒素的长期摄入。然而，能够降低生长期玉米籽粒中黄曲霉毒素水平的RNA干扰（RNA interference，RNAi）抑制技术已经得到成功应用。这种新方法利用了近期的两项科学研究发现：一是所有的真核细胞都拥有基因抑制机制，包括一种被称为Dicer的蛋白质，这种蛋白质使用“一个由小干扰RNA（Small Interfering RNA，siRNA）组成的模板分子”；另一个发现是这些siRNA分子能够在植物宿主和污染病原体之间穿越；当带有特殊序列的siRNA分子被引入病原体并在其中表达时，它会开始降解含有与引入siRNA同源序列的内源转录子；其结果是，通过引入专门设计的siRNA，病原体体内的靶基因表达表现为沉默或受到抑制。如果某一基因的RNA转录能够通过这种方式被抑制，那么该转录就不能被翻译成蛋白质。同时，由于蛋白质的缺失，相应的酶会失去活性；在本例中，该靶酶是毒素生物合成途径的一个组成部分，因此病原体就不能产生毒素。如果需要沉默的基因位于表达病原体本身的siRNA中，那么该技术被称作RNAi技术。该技术被证实是研究各种生物体基因功能的一项有用技术。如果该siRNA在某一生物体（如宿主细胞）中表达（本文指玉米细胞），而此靶基因在污染病原体体内会被抑制，RNAi抑制就超越了物种界限，这就是宿主诱导基因沉默（Host-Induced Gene Silencing，HIGS）技术。

2 靶向特定基因

在研究中，HIGS技术通过表达一种能够在真菌黄曲霉毒素通路中靶向作用生物合成基因的RNAi盒来抑制被曲霉菌污染的玉米产生毒素。选择通过RNAi技术来靶向抑制的基因为真菌聚酮合成酶基因（即aflC）。之所以选择这个基因，是因为它编码的一种蛋白质是生成全部四种黄曲霉毒素化合物的生物合成前体所必需的，因而抑制该酶的合成将导致曲霉菌不能产生毒素。另外，聚酮合成酶的编码基因很大，因此选择它作为抑制的目标，以提高在RNAi盒中使用该基因区域的可行性。RNAi盒只对曲霉菌基因有效，对宿主玉米或任何下游消费者（如人类、猪、牛等）表达的任何基因都不会表现出显著的同源性。具体而言，所选择的三个特定区域长度大约为200 bp，是真菌聚酮合成酶基因在可食用玉米籽粒部分中构建能够表达RNAi抑制盒的区域。经生物信息学分析可知，所选曲霉菌aflC基因的三个区域与玉米、人、猪或牛的基因组没有同源性。所选靶基因的三个区域将会被完全抑制，而不是仅仅缩短其长度，使编码的酶仍保留一定的活性，或者是降低污染性黄曲霉菌产生耐药性的概率，因为谷物的耐药性可能由该病原体中aflC基因的三个正在突变的目标域组成。研究人员已经成功培育出转基因玉米，同时分子分析显示它能表达具有除草剂抗性的選择性标记物Bar基因和插入式RNAiaflC基因盒。在RNAiaflC基因盒成功插入前，这种RNAiaflC表达水平最高的转基因玉米采用自我授粉。研究人员种植了这种来自表达植物的玉米籽粒，但授粉10 d后玉米棒上仍生长出了一种可产生黄曲霉毒素的知名曲霉菌且数量相同。该感染在玉米籽粒的生长期持续保持30 d。在感染的最后，研究人员收集每个感染点周围的玉米籽粒，并将每一株玉米的籽粒混合在一起以检测毒素的含量。每个玉米棒感染3～4次，每个感染点周围有6～8颗籽粒。研究人员检测了所有非转基因对照玉米籽粒，测试结果为黄曲霉毒素含量介于1 000 μg/kg～220 000 μg/kg；然而，研究人员未能从转基因玉米籽粒中检测到毒素（图1）。

随后，研究人员使用定量反转录-聚合酶链式反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）方法测定从感染玉米组织中提取到的RNA，结果显示，该目标aflC基因在与转基因籽粒互作的真菌组织中都没有表达，但在非转基因玉米籽粒中有表达，而另一个用作表达对照的几丁质合成酶在转基因和非转基因的受污染玉米籽粒中都有同等水平的表达。这些研究结果表明HIGS技术能用来减少生长期玉米籽粒中黄曲霉毒素的污染，从而能够降低全球食物/饲料中的黄曲霉毒素水平。

3 探索计划外的基因抑制

RNAi和HIGS技术在很大程度上依靠靶序列的特异性来抑制目标基因的表达。这种技术的一个潜在风险就是引入的siRNA分子可能不仅仅与靶基因具有序列同源性，甚至可能与其他所希望的目标基因也有同源性；就HIGS来说，其可能会与互作的生物体共用相似的基因而引起不必要的基因抑制。这种不必要的基因抑制通常会在生物技术群体中产生“计划外的表现型”或“非靶向”表达。本研究向玉米籽粒中引入了siRNA分子，其目的是研究随着RNAiaflC盒的引入是否会对内源性玉米RNA转录子产生任何不必要的抑制。试验用的RNA提取自2个非转基因对照玉米和3个表达RNAiaflC的转基因玉米。所有RNA转录样本通过一个新的两两比较法进行彼此间比较，尤其要注意转基因玉米和非转基因对照玉米的6组比较。尽管转基因组和非转基因组的每一两两比较能产生70～100个显著转录差异，但是在对这6个转基因和非转基因玉米的两两比较时，研究人员发现与非转基因对照组相比较，转基因样本中的任何一个转录均始终未见到始终如一的显著差异。这说明当对两个样本（转基因/非转基因）进行比较时，由于玉米作物在自身的微环境和所处的生长阶段上略微不同，它们在转录水平上还存在微小的差异。

然而，为了研究所引入的RNAi盒的表达在玉米籽粒中是否会出现转录上的差异，研究人员分析了6组两两对比，结果没有在转基因玉米籽粒中发现有持续不同的转录水平。如果所引入的RNAiaflC盒由于与玉米内源性基因具有同源性而引起非靶向表达，那么我们可以期待此RNA转录分析应该显示。与2个非转基因对照组相比，3个转基因组的基因表达会被持续地抑制。这表明如果用来构建RNAi抑制盒的序列特异性地靶向作用于需抑制的基因，那么就不会发生非靶向或计划外表型的事件。证明在RNAiaflC转基因玉米籽粒和对照组玉米上的转录无显著差异是朝着证明实质上等值的第一步，在本质上证明了该生物技术产品能在各个方面（引入的特性除外）与非转基因对照相当，这是在生物技术特性迈向商业化时的一个调控手段。

该研究还表明，对于减少收获前玉米中黄曲霉毒素的含量，HIGS技术是一项既有应用前景又令人兴奋的手段；基于此，此项技术还可引入到其他对黄曲霉毒素敏感的作物，并可用于抑制其他真菌产生霉菌毒素。应用HIGS技术来抑制霉菌毒素合成路径对提高人类健康以及增强全球食品安全性和稳定性来说是一个强大的工具。