蔡春霞 李茂业 陈德鑫 潘敬 刘明科 齐禹哲 肖丽娜 任春燕 刁朝强 徐传涛 沈祥祥 邓双跃
摘 要:为明确田间自然罹病烟蚜僵虫上的真菌种类和筛选出对烟蚜的高毒力菌株,将采集的烟蚜僵虫经过常规分离、纯化,进行了菌落生长、产孢量、形态观察、ITS序列测定、系统发育树构建以及对室内烟蚜毒力测定的研究。结果表明,从烟蚜僵虫体上分离纯化出8株菌株,经生物学特性观察、ITS序列对比和构建系统发育树准确鉴定出这8株菌株均是蜡蚧轮枝菌。综合生物学培养和毒力测定结果,得出菌株V4为优良菌种,具有产孢量高(1.89×109个/皿),生长速率快(15 d菌落直径达到68.78 mm),对烟蚜毒力强(第7天的校正死亡率为84.99%,LT50为4.51 d)的特性,具备田间持续控制烟蚜的潜力。
关键词:蜡蚧轮枝菌;烟蚜;生物学特性;系统发育树;致病性
中图分类号:S435.72 文章编号:1007-5119(2018)05-0086-08 DOI:10.13496/j.issn.1007-5119.2018.05.012
Abstract: The objectives of this study are to identify the species of fungi collected from naturally diseased Myzus persicae(Sulzer) aphids in the field and to screen the highly virulent strains against M. persicae aphids. After conventional isolation and purification of the collected diseased M. persicae aphids, the strains were used for colony growth, sporulation, morphological observation, ITS sequence analysis, phylogenetic tree construction and indoor toxicity determination. The results showed that: 8 strains were isolated systematically from diseased M. persicae aphids which were Verticillium lecanii through identification by biological characteristics, ITS sequence comparison and phylogenetic tree construction. Strain V4 was selected based on biological culture and virulence test. Strain 4 showed more sporulation yields (1.89×109 / dish), fast growth rate (reached 68.78 mm at 15 days), batter pathogenicity to M. persicae aphids (7 day corrected mortality was 84.99% and the LT50 was 4.51 d) which has the potential to control the M. persicae aphids continuously in the field.
Keywords: Verticillium lecanii; Myzus persicae aphids; biological characteristics; phylogenetic tree; pathogenicity
大面積使用化学农药导致环境污染、农药残留和昆虫产生抗药性等问题日益突出[1],近年来以生物防治为主的害虫防治策略受到广泛重视[2]。在众多的微生物杀虫剂中,昆虫病原真菌具有易侵染寄主、扩散范围广、宿存时间长、寄主不易产生抗性、易进行规模化生产等优势[3],因此,昆虫病原真菌在控制害虫种群数量方面起着至关重要的作用[4],被认为是化学杀虫剂的重要辅助品或者替代品[5-6]。
相关研究表明,在自然界中,真菌流行病引起昆虫死亡率达到60%,可以看出昆虫病原真菌对控制害虫种群消长的作用非常大[7]。王清海等[8]报告,我国已发现的昆虫病原真菌涉及40多属405种;国际上登记注册的真菌杀虫剂主要有球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)、金龟子白僵菌(Metarhizium anisopliae)、玫烟拟青霉(Paecilomyces furmosoroseus)和蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii)等[9]。ZHANG等[10]从红脂大小蠹中筛选出12株白僵菌,其中致病性最强的菌株Bb202,当它的分生孢子浓度为1.0×107孢子/mL时,LT50为4.60 d。张松影等[11]从褐飞虱罹病虫体上分离出一株黄绿绿僵菌Mf82,将该菌株以1.0×108孢子/mL的孢子液接种到褐飞虱成虫体表上,累计校正死亡率达83.8%,LT50为4.47 d。孔琼等[12]研究蚜虫上分离出的蜡蚧轮枝菌对月季长管蚜的致病性会随着孢子浓度的增加而增强,当浓度为2.0×108孢子/mL对月季长管蚜感染致死的LT50=(4.69±0.16)d,第8天的死亡率达93.6%。从自然界的僵虫上可以分离出多个菌株,但是不同的昆虫病原真菌菌株间的差异性较大,因此在鉴定出菌株种类后需要进一步对菌株的致病性进行研究。
本文从贵州烟田采集自然罹病烟蚜,分离纯化出真菌,通过菌落生长培养、产孢量测定、显微观察进行形态鉴定;通过ITS序列测定以及系统发育树构建进行分子鉴定,以准确鉴定僵虫上真菌的种类。将分离鉴定出来的菌株对烟蚜进行室内毒力测定,以明确菌株致病性,为烟蚜以及其他农业害虫的生物防治提供基础,以减少化学农药的使用对环境的污染和天敌昆虫的药害。
1 材料与方法
1.1 菌株来源
八个菌株分别编号为V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8,均分离纯化自贵州省贵阳市开阳县烟田烟草植株上自然罹病的烟蚜虫体。
1.2 供试昆虫
烟蚜饲养于安徽农业大学植物保护学院温室内种植的烟草。
1.3 培养基
SDAY培养基:10%酵母浸出粉、40% 葡萄糖、10% 蛋白胨、20% 琼脂、pH为6.0±0.1。
L-broth培养基:1% 蛋白胨、0.5% NaCl、0.3%酵母浸出粉、2%蔗糖、2%琼脂。
PDA培养基(购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)成分:6 g/L马铃薯浸粉、20 g/L葡萄糖、20 g/L琼脂、pH值为5.6±0.2。
1.4 分离与保存
将罹病蚜虫从烟叶上挑下,表面消毒后,直接放到PDA培养基中培养,经过多次培养后,纯化出8个菌株,并将8个菌株做成试管斜面保存于4 ℃冰箱,进行定期转管保存,同时,制作成甘油菌,进行长期保存。
1.5 菌株系统鉴定
形态鉴定:将分离纯化后的菌株配成孢子悬液,吸取2.5 μL接在直径9 cm的培养皿上培养观察。每个菌株使用3种培养基培养,每种培养基3个重复。放置在光照16 h∶黑暗 8 h,温度为25 ℃的恒温箱内培养。在菌落长出后每天下午16:00用十字交叉法测量菌落的直径,连续测量15 d,观察菌株的生长形态并拍照。在第15天测定菌株的产孢量。
光学显微镜标本的制作:在载玻片上滴一滴无菌水,用接种针挑取一定的菌苔,盖上盖玻片,反置在显微镜下进行观察。
分子鉴定:结合LIU等[13]的方法提取菌株的DNA。选用通用引物ITS-4(5′-TCCTCCGCTTAA AG-ATATGC-3′)和ITS-5(5′GGAAGTAAAAGTC-G TAACAAGG-3′),引物由安徽通用生物系统有限公司合成。PCR扩增的反应体系为25 μL,反应组分为:2×Es Taq MasterMix (Dye) 12.5 μL,10 μmol/L的上游引物 0.5 μL,10 μmol/L的下游引物0.5 μL, 模板DNA提取液0.5 μL,ddH2O 11 μL。混合液在PCR仪上进行扩增,反应程序为:94 ℃预变性2 min, 进入循环,94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸18 s,30个循环后72 ℃延伸2 min,25 ℃保温5 min。取5 μL扩增产物于1.2%琼脂糖凝胶中电泳,EB染色后,于紫外灯下观察,并于凝胶成像系统上检测。利用引物ITS-4对PCR产物进行直接测序,测序工作由上海生工生物工程股份有限公司完成。将测序结果与NCBI中的GenBank基因数据库的菌株序列进行对比[14]。根据测序序列,利用Mega 7.0.26软件构建系统发育树。
1.6 对烟蚜致病力测定
采用微量点滴法。将分生孢子配制成浓度约为 1.0×107孢子/mL的孢子悬液。挑选长势一致、健康的无翅烟蚜,用50 μL注射器滴在烟蚜前胸及背面,每种菌株3次重复,每个重复20头烟蚜,同时以0.05%吐温-80做对照。将处理后的烟蚜放在用滤纸铺底保湿具新鲜烟叶的培养皿(直径为9 cm)中,用保鲜膜封口并用针扎孔通气,做好标记,放在常温下培养观察。每24小時观察一次存活情况,记录死亡数,观察期间适量加蒸馏水保湿。烟蚜的死亡判断以毛笔触足和触角完全不动为标准,以后期长出菌丝为有效死亡。
1.7 数据分析
用Abbott公式计算校正死亡率:
数据分析采用DPS数据处理系统软件完成,用Duncan新复极差法进行差异显著性分析。
2 结 果
2.1 八株菌株产孢量及在3种培养基上的生长速率
由表1看出,8株菌株在PDA培养基上第15天的产孢量间有极显著差异(F=521.40,P=0.00;n1=7, n2=17),产孢量的高低分别是:菌株V4产孢量最高,为1.89×109个/皿,与其他菌株的产孢量呈现极显著差异。产孢速率快慢为:菌株V4>V7>V2> V5>V3>V6>V1>V8,菌株V8产孢量最小,为1.08×107个/皿。除了菌株V1、V8,其他6个菌株间存在显著差异(p<0.05)。
由表2看出,8株菌株在PDA、SDAY、L-broth 3种培养基上均能迅速生长,其中菌落在SDAY(F=31.80, P=0.00;n1=7, n2=16)、L-broth(F=30.40, P<0.01;n1=7, n2=16)培养基上生长较快,在PDA(F=39.30, P=0.00;n1=7, n2=16)培养基上生长较慢。在第15天中,V3、V7在3种培养基中生长的菌落直径呈现极显著差异,菌落V3(F=412.00,P<0.01;n1=2, n2=5)在3种培养基上的生长速率为L-broth>SDAY>PDA;菌株V7(F=133.60,P=0.0013;n1=2, n2=5)在3种培养基上的生长速率为L-broth﹥SDAY﹥PDA;菌株V2在3种培养基上的生长速率无明显差异。菌株V1、V5、V6在SDAY、L-broth和PDA培养基中的生长速率呈现极显著差异,在3种培养基上生长速率为SDAY、L-broth>PDA;菌株V1、V4、V6、V8在SDAY培养基上生长速率较快,菌株V2、V3、V5、V7在L-broth培养基上生长速率较快。
2.2 八株菌株在3种培养基上的生长形态
八株菌株在L-broth、SDAY、PDA 3种培养基上的形态存在相似性。相同点为8株菌落正面均为白色,具同心轮纹。不同点为8株菌株的同心轮纹形状各不相同,菌株V8菌落与其他7个菌株有明显的区别,V8菌落呈絮状且凸起,背面呈红色,菌株V1到菌株V7的菌落均不凸起,呈微粉状,背面呈白色(图1、2、3)。
2.3 光学显微镜下八种菌株的形态
八株菌株的分生孢子均是透明的,表面光滑,孢子呈柱状,末端圆而对称,几乎为单胞,少见双胞(图4)。
2.4 测序结果
菌株V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8的核糖体DNA-ITS长度分别为614、563、572、576、577、553、571和578 bp(图5)。
将序列提交到NCBI GenBank数据库,经Blast比对鉴定为蜡蚧轮枝菌( Verticillium lecanii ),得到同源性最高的蜡蚧轮枝菌ITS序列登记号分别为NR_111101.1、KU612379.1、KU612378.1、KJ160143.1、LC035041.1、JQ901939.1、AB378513.1、AB160994.1。
利用8株菌株序列在NCBI的GenBank库进行比对并下载相应菌株的ITS序列,一并用MEGA7.0.26软件的Alignment程序进行多重对位排列,通过系统发育分析构建出系统进化树。经鉴定这8株菌株均为蜡蚧轮枝菌属(Lecanicillium),其中菌株V3与Torrubiella在进化关系上极为密切,可能为有性态[15](图6)。
2.5 八株菌株对烟蚜的致病性
将8株菌株都配制成1.0×107孢子/mL的孢子悬液进行接种,生物学测定结果表明(表3),空白对照的成虫在第7天的平均累计自然死亡率为6.67%。各菌株处理在第7天的累计校正死亡率为33.37%~ 84.99%。不同菌株间差异显著(F=7.54,P<0.01;n1=7, n2=17)。其中,烟蚜校正累计死亡率最低的菌株为V7,为33.37%,最高的为菌株V4,达到84.99%。
LT50可反映出菌株对目标害虫的致病力,LT50越短致病力越强。8株菌株中有6株菌株的LT50<10 d,其中表现出对烟蚜较强毒力的2株菌株V4、V6的LT50<7 d,V4最短,为4.51 d(95% CI:3.82~5.78);LT50>10 d的菌株有2个(V3、V7),表明它对烟蚜的致病性较差。
3 讨 论
本研究从贵州烟田里采集的自然罹病烟蚜通过分离纯化出真菌后,经过形态鉴定、分子鉴定为8株蜡蚧轮枝菌,由毒力测定表明这些菌株对烟蚜具有致病性,并筛选出一株对烟蚜具有高毒力的菌株。这与蜡蚧轮枝菌作为寄主种类繁多的昆虫病原真菌并且对蚜类[16-18]具有防治效果这些报道一致。
不同培养基是影响真菌生长和产孢量的重要原因,有研究表明虫生真菌可以在多种营养条件下生长,但是适宜的营养条件不仅可以促进生长还能增强菌株的杀虫活性。GAO等[19]研究表明当培养基中添加酵母浸出粉作为氮源时,有利于菌株的菌丝生长和孢子的产孢。刘春来等[20]发现葡萄糖跟酵母浸出粉是有利于蜡蚧轮枝菌生长的碳源、氮源。在本研究中,蜡蚧轮枝菌在SDAY、L-broth 培养基上的生长速度明显快于PDA培养基,这与已有报道相符。VARELA等[21]研究白僵菌对咖啡蛀虫的防治试验表明,孢子萌发率越高和菌丝生长速度越快的菌株对咖啡蛀虫的毒力较强。李茂业等[22]研究表明绿僵菌菌丝生长快,产孢量大,对褐飞虱的毒力强。本试验中菌株V4的生长速度、产孢量均明显优于其他7株菌株,其对烟蚜的毒力也较强。
LATCH[23]和POPRAWSKI等[24]認为高毒力的真菌菌株分离于原寄主或原寄主的亲缘种僵虫。李国霞[25]从白粉虱虫体上分离出11个菌株,生物测定出4号菌株对白粉虱的致病性最强。林华峰[26]从田间褐飞虱罹病虫体分离的一株绿僵菌对褐飞虱的室内致死率达84%以上。本实验从自然罹病烟蚜上分离出8株蜡蚧轮枝菌,菌株V4对烟蚜的校正累计死亡率达到84.99%。但是这些菌株之间是否有协同增效作用还需要进一步研究。
4 结 论
从贵州烟田采集的自然罹病蚜虫上分离出了8株菌株,在L-broth、SDAY、PDA 3种培养基上培养观察它们的生物学特性,通过系统鉴定后确定皆为蜡蚧轮枝菌。对烟蚜进行室内生物学培养和毒力测定实验发现,菌株V4的产孢量最高,生长速率最快,致病性最强,具有进一步开发对烟蚜田间防治或者其他农业害虫生物防治的潜力。
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