蚕豆萎蔫病毒2号安徽分离物全基因组序列测定与分析

严丹侃 郑红英 张海珊 沈艳 顾江涛　章东方　燕飞

摘要

利用酶联免疫和RTPCR技术对采自安徽地区的蚕豆病株进行检测，确定其病原为蚕豆萎蔫病毒2号Broad bean wilt virus 2 （BBWV2）。为明确BBWV2安徽分离物（BBWV2AH）的分类地位，克隆了该分离物的全基因组序列，分析了其基因组特征。结果表明，BBWV2AH RNA1全长为5 944 bp （GenBank登录号： KY606992），含有1个ORF；BBWV2AH RNA2全长3 587 bp （GenBank登录号： KY606993），含有1个ORF。全序列核苷酸和氨基酸相似性分析显示，BBWV2AH RNA1与BBWV2其他分离物的核苷酸、氨基酸相似性分别为78.4%～96%和87.1%～99%；BBWV2AH RNA2与BBWV2其他分离物的核苷酸、氨基酸相似性分别为76.8%～95.5%和88.2%～98.3%。全基因组核苷酸序列系统发育分析显示，BBWV2AH RNA1与中国的BBWV2Hunan RNA1的亲缘关系最近，而BBWV2AH RNA2与韩国的多个分离物聚集在一起，再与中国的分离物BBWV2B935形成一个分支。

关键词

蚕豆萎蔫病毒2号； 安徽分离物； 基因组； 序列分析

中图分类号：

S 435.23

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017158

Identification and analysis of complete genomic sequence of

Broad bean wilt virus 2 Anhui isolate

YAN Dankan1， ZHENG Hongying2， ZHANG Haishan1， SHEN Yan1，

GU Jiangtao1， ZHANG Dongfang1， YAN Fei2

（1. Institute of Plant Protection and AgroProducts Safety， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei 230031， China；

2. Institute of Virology and Biotechnology， Zhejiang Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310021， China）

Abstract

BBWV2 was detected from broad bean plants in Anhui Province by DASELISA and RTPCR.To further characterize the BBWV2 Anhui isolate （BBWV2AH）， complete nucleotide sequence of BBWV2AH was determined.Sequence analysis suggested that BBWV2AH RNA1 was comprised of 5 944 nucleotides， encoding one ORF （GenBank accession no. KY606992）； BBWV2AH RNA2 was comprised of 3 587 nucleotides， also encoding one ORF （GenBank accession no. KY606993）. The comparison of nucleotide sequences suggested that RNA1 and RNA2 of BBWV2AH shared 78.4%-96% and 76.8%-95.5% nucleotide sequence identity with those of other BBWV2 isolates， respectively. Furthermore，the comparison of amino acid sequences suggested that RNA1 and RNA2 of BBWV2AH shared 87.1%-99% and 88.2%-98.3% amino acid sequence identity with those of other BBWV2 isolates， respectively. Phylogenetic analysis based on nucleotide sequences showed that RNA1 of BBWV2AH isolate was most closely related to BBWV2Hunan isolate， while RNA2 of BBWV2AH formed an independent branch with several Korean isolates， and was then closely related to BBWV2B935 from China.

Key words

Broad bean wilt virus 2； Anhui isolate； complete genome； sequence analysis

蚕豆是我国重要的经济作物，据FAO统计，我国2014年蚕豆收获面积为92.5万hm2，总产量为159.5万t，是世界蚕豆生产第一大国，产量占世界蚕豆总产量的36.7%[1]。蚕豆萎蔫病毒Broad bean wilt virus （BBWV）是危害蚕豆的主要病毒，该病毒为豇豆花叶病毒科Comoviridae蚕豆病毒属Fabavirus的典型种，其基因组由2条单链RNA分子组成，分别是60 kb的RNA1和3.6 kb的RNA2。BBWV有2种血清型，依据血清型差异将其区分为2個种，即BBWV1和BBWV2[2]。

我国尚未见到BBWV1发生报道，而BBWV2则普遍发生。BBWV2通过汁液摩擦或蚜虫以非持久性方式传播，不仅能侵染豆类作物[34]、蔬菜、烟草、花卉和中草药[57]，还能侵染葡萄等多种木本植物，引起花叶、矮化、萎蔫和植株枯死，造成严重危害[8]。周雪平等[9]测定了BBWV2中国分离物 （B935） 的全基因序列，并对其基因表达及蛋白功能进行了深入分析。牛颜冰等[10]对山西太谷范村蔬菜种植基地的青椒病害进行调查，

明确青椒病毒病病原为BBWV2，并获得BBWV2青椒分离物（BBWV2Ca）的基因组全序列。王晓燕[11]完成侵染一串红的BBWV2分离物S4的分子鉴定和基因组测定，明确其与已报道的BBWV2、辣椒分离物XJP11和番茄分离物XJ143a的序列差异。本研究对侵染安徽蚕豆的病毒分离物BBWV2进行了鉴定，报道了BBWV2安徽蚕豆分离物（BBWV2AH）的基因组全序列，并与已报道的BBWV2分离物进行系统进化关系分析，为研究BBWV2的基因遗传和变异提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

病毒病样：2016年3月，蚕豆病样采集于安徽省长丰县岗集镇安徽省农业科学院岗集试验基地，保存于-70℃冰箱中备用。

主要试剂：Mini BEST Plant RNA Extraction Kit和PrimeScriptTMOne Step RTPCR Kit购自TaKaRa公司，克隆载体pUCmT和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒等购自上海生工生物工程有限公司，蚕豆萎蔫病毒检测试剂盒（DASELISA）购自美国Agdia公司。

引物：用于BBWV2AH全基因组序列扩增的10对引物（表1）参考牛颜冰等[7]和HaeRyun Kwa[1213]的报道。引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

病毒RNA：使用Mini BEST Plant RNA Extraction Kit提取100 mg蚕豆叶片的总RNA，保存于-80℃备用。

1.2 方法

蚕豆萎蔫病毒检测试剂盒（DASELISA）检测参照说明书进行。

BBWV2AH全基因组序列的RTPCR扩增：以BBWV2AH侵染发病的蚕豆叶片组织总RNA为模板，按照PrimeScriptTM One Step RTPCR Kit说明书，以蚕豆萎蔫病毒外壳蛋白大亚基基因引物和覆盖BBWV2全基因组序列的RNA1的6对引物和RNA2的4对引物进行PCR扩增（表1）。在1×TAE电泳缓冲液中，经1%琼脂糖电泳分离PCR产物。

BBWV2AH全基因组序列的克隆和测序：使用UNIQ10柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR产物并纯化，再与pUCmT载体连接，转化入大肠杆菌DH5α后培养，每个片段选取多个克隆进行鉴定，将阳性克隆委托生工生物工程（上海）股份有限公司测序，每个片段通过比对选择3个测序结果相同的序列作为最终测序结果，拼接测序结果，获得BBWV2AH全基因组序列。

BBWV2AH全基因组序列分析：从GenBank中获得BBWV2其他39个分离物全基因组序列，以同属的广藿香轻型花叶病毒Patchouli mild mosaic virus（PatMMV）[1415]和蚕豆萎蔫病毒1号Broad bean wilt virus 1（BBWV1）[16]为外群，根据其基因组RNA1和RNA2序列，使用DNAstar软件中的MegAlign进行开放阅读框及非编码区序列比对分析，使用MEGA 6.0[17]进行系统发育树分析，采用邻位相接聚类分析法分别构建系统发育树，用1 000次重复的自展检验评价系统发育树拓扑结构的可靠性。

2 结果与分析

2.1 蚕豆萎蔫病毒及其外壳蛋白大亚基基因（LCP）的检测

使用蚕豆萎蔫病毒检测试剂盒（DASELISA）對采集自安徽的蚕豆病株叶片和健康叶片进行检测。病株叶片检测结果呈现黄色，为阳性，表明其中含有蚕豆萎蔫病毒；而健康叶片检测结果为透明，为阴性，表明不含蚕豆萎蔫病毒。使用BBWV2的外壳蛋白大亚基基因（large coat protein，LCP）引物BBWV2 LCPF和BBWV2 LCPR从蚕豆病株叶片中可扩增出约1 200 bp的条带，而健康蚕豆叶片未扩增出条带（图1），对扩增得到的条带进行克隆后测序，序列比对结果显示为蚕豆萎蔫病毒2号外壳蛋白大亚基基因（LCP）。

2.2 BBWV2AH基因组全序列的克隆与测定

2.2.1 BBWV2AH RNA1的克隆

为明确BBWV2安徽分离物BBWV2AH的分类地位，以提取的蚕豆病株叶片RNA为模板，分别以BBWV211u/BBWV211r、BBWV212f/BBWV212r、BBWV2（RNA1）F2/BBWV2（RNA1）R2、BBWV2（RNA1）F3/BBWV2（RNA1）R3、BBWV2（RNA1）F4/BBWV2（RNA1）R4和BBWV2（RNA1）F5/BBWV2（RNA1）R5为引物进行BBWV2AH RNA1克隆。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，分别得到大小为1 081、1 076、881、1 084、1 562 bp和1 767 bp的目的片段（图2），测序后进行序列拼接，获得BBWV2AH RNA1全长为5 944 bp，含有1个ORF，始于216 bp，终止于5 828 bp，

2.2.2 BBWV2AH RNA2的克隆

以蚕豆病株叶片总RNA为模板，分别以BBWV2（RNA 2）1F/BBWV2（RNA 2）1R、BBWV2（RNA 2）2F/BBWV2（RNA 2）1d、BBWV2（RNA 2）2u/BBWV2（RNA 2）2r和BBWV2（RNA 2）3u/BBWV2（RNA 2）3d为引物进行PCR扩增。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测分别得到大小为951、875、1 092 bp和1 136 bp的目的片段（图3），测序后序列拼接分析表明BBWV2AH RNA2全长3 587 bp，含有1个ORF，始于209 bp，终止于3 406 bp，编码1 065个氨基酸。

2.3 BBWV2AH分离物基因组序列分析

利用DNAStar软件对BBWV2AH RNA1（KY606992）全序列与来自韩国、中国、日本、新加坡和菲律宾的39个BBWV分离物进行核苷酸序列、氨基酸序列同源性分析。BBWV2AH RNA1与BBWV2其他分离物核苷酸同源性为78.4%～96%，氨基酸同源性为87.1%～99%。与来自中国湖南的分离物BBWV2Hunan RNA1 （KJ789403.1）核苷酸、氨基酸同源性均为最高；与外群PatMMVPhilippines分离物RNA1 （NC003975）核苷酸、氨基酸同源性为89.3%和95.7%；与BBWV1Ben分离物RNA1 （AY781171）核苷酸、氨基酸同源性分别为64.4%和60.6%（表2）。

将BBWV2AH RNA2（KY606993）与来自中国、韩国、日本、新加坡和菲律宾的18种分离物进行核苷酸序列、氨基酸序列同源性分析。BBWV2AH RNA2与BBWV2其他分离物核苷酸同源性为76.8%～95.5%、氨基酸同源性为88.2%～98.3%。与韩国BBWV2RP4分离物RNA2 （JX183228.1）核苷酸同源性最高、与中国分离物BBWV2B935 RNA2 （AJ132844）和韩国分离物BBWV2RP5 RNA2 （JX183230.1）氨基酸同源性最高；与外群PatMMVPhilippines分离物的RNA2（NC003974）核苷酸、氨基酸同源性为83.9%和91.9%；与BBWV1Ben分离物RNA2 （AY781172）的核苷酸、氨基酸同源性分别为56.2%和58.3%（表2）。

2.4 BBWV2AH与其他分离物系统进化分析

为研究BBWV2AH的起源与进化关系，以同属的BBWV1Ben和PatMMVPhilippines为外群，分别构建该分离物与已报道的BBWV2分离物的RNA1和RNA2核苷酸序列系统进化树（图4～5）。从进化树上可以看出，BBWV2AH RNA1与中国的BBWV2Hunan的亲缘关系最近，并与中国的分离物BBWV2B935、BBWV2SG1、BBWV2XJP11、BBWV2Ca和BBWV2XJ143，韩国的分离物BBWV2LS2、BBWV2DO、BBWV2BBWVBRI、BBWV2SN、BBWV2K、BBWV2RP3、BBWV2BB5、BBWV2P2、BBWV2P3和日本的分离物BBWV2MB7、BBWV2IA聚集成一个大支。而韩国的其他分离物和新加坡的BBWV2ME分离物成一大支。以上两支与西班牙的BBWV1Ben分离物亲缘关系较远（图4）。

从构建的BBWV2 RNA2系统进化树（图5）可以看出BBWV2AH分离物与韩国的分离物BBWV2RP1（JX183222）、BBWV2RP1（KT380023）、BBWV2RP2、BBWV2GP2、BBWV2GP4、BBWV2GP5、BBWV2RP5、BBWV2SP1、BBWV2SP2、BBWV2RP6、BBWV2BB9、BBWV2RP3、BBWV2RP4、BBWV2BB5、BBWV2PAP3、BBWV2PAP2、BBWV2PAP1、BBWV2P2、BBWV2P3、BBWV2SP以及中国的分离物BBWV2B935形成一个独立分支，亲缘关系最近。该分支再与韩国的分离物BBWV2K、BBWV2SN、BBWV2DO、BBWV2BBWVBRI，中国的分离物BBWV2XJ143、BBWV2Hunan、BBWV2SG1和日本的分离物BBWV2IA、BBWV2MB7形成一个大支。其他的分离物形成另一大支，与BBWV2AH亲缘关系相对较远。以上两个分支均与西班牙的BBWV1Ben分离物亲缘关系最远。

3 讨论

BBWV2寄主范围广，在蚕豆、辣椒、番茄等上均有发生，是我国豆科作物和一些重要蔬菜作物上的主要病毒病。蚕豆被病毒侵染后往往出现花叶、矮化、萎蔫直至枯死等症状，导致生长受阻，产量和品质下降。作者通过酶联免疫和外壳蛋白大亚基基因的RTPCR法对田间具有明显矮缩、萎蔫症状的蚕豆进行了检测，发现了蚕豆萎蔫病毒2号存在，并克隆、测定了BBWV2安徽分离物（BBWV2AH）全基因组序列。

为进一步明确BBWV2AH的分类地位和系统发育关系，将BBWV2AH RNA1与39个不同来源的BBWV2进行核苷酸序列、氨基酸序列同源性比较分析。结果表明，我们从蚕豆上鉴定的BBWV2AH 分离物的RNA1与湖南的辣椒分离物BBWV2Hunan核苷酸、氨基酸同源性均为最高，而RNA2则与韩国辣椒分离物BBWV2RP4的核苷酸同源性最高、与中国蚕豆分离物BBWV2B935和韓国辣椒分离物BBWV2RP5的氨基酸同源性最高。进一步将获得的安徽分离物BBWV2AH全基因组序列和39个蚕豆病毒属分离物进行系统发育分析，发现BBWV2AH RNA1与中国的BBWV2Hunan RNA1的亲缘关系最近，而BBWV2AH RNA2与韩国的多个分离物聚集在一起，再与中国的分离物BBWV2B935形成一个分支，与序列同源性分析结果基本一致。BBWV分离物RNA1和RNA2在系统进化关系及聚类分析中表现的差异是否与该病毒在田间容易通过蚜虫在不同种类的寄主植物间传播相关？该病毒在长期的进化过程中是否通过重组或重排以适应多种不同寄主植物并扩展其寄主范围等问题还需要进一步研究。

本研究测定了BBWV2安徽分离物（BBWV2AH）全基因组序列，分析了其与已报道的BBWV2其他分离物的序列差异和系统发育关系，发现了BBWV2 RNA1和RNA2与其他分离物聚类分析时的差异，为揭示该病毒的基因组进化方式提供了信息。

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（责任编辑：田 喆）