气相色谱-质谱联用法测定植物组织中糖与糖醇

项 萍，唐 喆

(西北农林科技大学植物保护学院，陕西 杨凌 712100)

糖醇类物质广泛存在于自然界各种生物中，植物体内的糖醇具有提供能量、清除自由基以及调节植物细胞渗透压等生理功能[1]。糖醇类物质是植物体内重要的初生代谢物，其含量的变化可直接反映植物组织的生理状况。枸杞作为西北半干旱地区常见的植物，不仅是常用的传统中药材，还是百姓喜爱的保健品。据研究报道，枸杞的果、叶、苗、根都含有多种营养和活性组分，其中以葡萄糖、阿拉伯糖为活性基础形成的水溶性多糖(LPB)[2]为主。

糖与糖醇类物质的检测方法一般有容量法、分光光度法、酶分析法、色谱分析法等[3-4]，但由于植物组织中糖醇类物质的浓度相对较低，使用上述方法很难得到准确的含量，因此有必要建立一种快速且灵敏的糖醇类物质分析方法。气相色谱法的灵敏度高、分离能力强，能够有效地分离天然化合物中的同分异构体，并能够对痕量物质进行检测；质谱法能够准确地确定化合物的分子质量，并且推算化合物的分子式，对于鉴定有机物分子具有重要作用。目前，气相色谱-质谱(GC/MS)联用技术已广泛应用于各种检测中[5-6]，然而，糖醇类物质高温易分解或难以气化，在进行GC/MS分析前要对化合物进行衍生化处理。

本研究拟以7种常见的糖醇类物质作为目标化合物，经乙酰化处理后，以核糖醇作为内标物，采用GC/MS法测定枸杞叶片和根系中的含糖情况，希望为各种植物组织中糖和糖醇类物质的检测提供方法参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

GC/MS-QP2010气相色谱-质谱仪：日本岛津公司产品，配有Aoc-20i自动进样器、Rxi-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；MD200氮吹仪：杭州奥盛仪器有限公司产品；PL303电子天平：梅特勒-托利多上海有限公司产品；THZ-C-1全温振荡器：苏州培英实验设备有限公司产品。

果糖(Flu)、核糖醇(Ado)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)、纤维醇(Ino)、甘露醇(Man)、山梨醇(Sor)、蔗糖(Suc)标准品：均为分析纯，美国Sigma公司产品；甲醇、氯仿、1-甲基咪唑、盐酸羟胺、乙酸酐、无水硫酸钠：均为分析纯，天津富宇精细化工有限公司产品。

1.2 乙酰化标准品的配制

精确称取各0.005、0.02、0.05、0.1、0.2 mg果糖、葡萄糖、半乳糖、纤维醇、甘露醇、山梨醇、蔗糖标准品，分别加入0.02 mg核糖醇，混匀，再加入少许的1-甲基咪唑悬浮；然后加入0.1 mL盐酸羟胺溶液，混匀后置于80 ℃水浴中振荡5 min，取出后加入0.15 mL乙酸酐，混匀，于室温下反应5 min；再加入1 mL氯仿萃取衍生化产物，然后用2倍体积水清洗4遍，有机相用无水硫酸钠干燥后，封装于色谱瓶中，即得质量浓度分别为5、20、50、100、200 mg/L的混合标准工作液，其中内标物核糖醇的浓度为20 mg/L。

1.3 样品提取以及乙酰化处理

对枸杞叶片与根系的单双糖及其可溶性糖醇类化合物进行GC/MS测定，具体步骤[1]为：取0.2 g枸杞鲜样，加入0.02 mg核糖醇作为内标，液氮环境中研磨成细碎粉末，加入4 mL甲醇-氯仿-水(12∶5∶3,V/V/V)碳水化合物抽提液，充分混匀，随后加入等体积水，混匀，静置片刻，将上清液过滤至试管中，氮气吹干，待其冷却后加入少许的1-甲基咪唑悬浮；然后加入0.1 mL盐酸羟胺溶液，混匀后置于80 ℃水浴中振荡5 min，取出后加入0.15 mL乙酸酐，混匀后于室温下反应5 min，加入1 mL氯仿萃取衍生化产物，用2倍体积水清洗4遍，有机相用无水硫酸钠干燥后，直接封装于色谱瓶中，待测。

1.4 实验条件

1.4.1色谱条件 载气He，流速0.8 mL/min；清洗流速3 mL/min，线速度32.4 cm/s；升温程序：柱温50 ℃，保持5 min，以15 ℃/min升至200 ℃，以10 ℃/min升至280 ℃，保持20 min；进样口温度250 ℃；进样量1 μL。

1.4.2质谱条件 轰击电压70 eV，界面温度280 ℃，离子源温度230 ℃，检测器电压0.9 kV，溶剂切割时间3 min，质量扫描范围m/z35～900。

2 结果与分析

2.1 8种乙酰糖的Scan模式定性分析

注：1.果糖；2.核糖醇(内标物)；3.葡萄糖；4.半乳糖；5.纤维醇；6.甘露醇；7.山梨醇；8.蔗糖图1 8种乙酰化的糖和糖醇的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of 8 acetylated sugars and sugar alcohols

将乙酰化后的标准品通过单标进样确定每种物质的保留时间，进混标样后优化升温程序、调整测试参数，从而达到较好的分离效果，得到的总离子流图示于图1。

2.2 SIM模式定量分析

SIM模式较Scan模式的灵敏度有很大提高[7]。本研究根据8种乙酰化标准品Scan模式的质谱图，选定特征离子创建了SIM方法，并对混合标样进行分析，得到的离子流图示于图2，乙酰化的糖和糖醇的SIM模式参考离子列于表1。由于糖和糖醇类物质含有较多的羟基，乙酰化处理后形成的酰氧键极易断裂形成m/z43碎片离子，且丰度较高，结合其他特征碎片和保留时间，可以高选择、高灵敏地检测糖和糖醇类物质的含量。

图2 8种乙酰化的糖和糖醇的SIM模式总离子流图Fig.2 Total ion chromatogram of 8 acetylated sugars and sugar alcohols at SIM mode

峰号Peaknumber糖和糖醇Sugarsandsugaralcohols保留时间tR/min参考离子Referenceions(m/z)1果糖12 3543，103，1452核糖醇13 6343，115，1453葡萄糖14 5643，145，1034半乳糖14 7943，145，1035纤维醇15 7443，168，1266甘露醇15 8743，115，1397山梨醇15 9643，115，1458蔗糖28 5843，169，211

2.3 SIM方法的检出限、回收率和精密度

分别取1.2节配制的标准混合工作液，采用1.3节方法对标准溶液乙酰化处理后，按1.4节条件上机测定。为了避免前处理过程导致的误差，选取植物组织中含量极少的核糖醇作为内标物，以其他标准品与核糖醇峰面积比y对7种标准物质量浓度与核糖醇比x做线性回归，以信噪比3计算检出限，信噪比10计算定量限，其结果列于表2。可见，除果糖的检出限为5.5 mg/L外，其他糖和糖醇的检出限均低于0.11 mg/L。

选取一组枸杞根样品，在前处理前添加一定量的可溶性糖进行分析检测，重复测定5次，考察该方法在实际样品中的回收率与精密度，结果列于表3。结果表明，回收率在96.98%～103.62%之间，相对标准偏差(RSD)为2.3%～4.9%，该方法精密度良好，能够满足定量分析的要求。

表2 乙酰化的糖和糖醇的工作曲线、相关系数、检出限和定量限Table 2 Regression equations, correlation coefficients,limits of detection and limits of quantification of 8 acetylated sugars and sugar alcohols

表3 SIM模式下方法的回收率和精密度Table 3 Recoveries and precisions at SIM mode

2.4 方法的应用

选取枸杞叶片与根系作为样本进行糖和糖醇的测定，结果列于表4。可见，枸杞根中的果糖、葡萄糖和蔗糖含量约是叶片中的2倍，这是因为根主要参与植物无机离子和水的吸收，需要大量的能量，这些糖类可为根提供更多的能量。半乳糖和纤维醇是植物细胞重要合成物的前体，其中，半乳糖是植物果胶类成分的重要组成，纤维醇可用于植物细胞壁的合成[8-9]，二者对枸杞的根和叶细胞具有同等重要的作用，二者的含量差异不大。山梨醇和甘露醇是单糖的重要衍生物，主要用于调节细胞渗透压，提高植物抗逆性[10-11]，由于根处于复杂环境中，需要对渗透压有良好的调节能力，所以山梨醇和甘露醇的含量较高。

实际的枸杞样品测定结果和理论分析表明，本实验采用的GC/MS选择离子监测(SIM)模式可以准确地测定植物组织中的糖醇含量。虽然样品的乙酰化处理增加了前处理步骤，但是操作简单，试剂为常规试剂，成本较低。同时，采用核糖醇作为内标物，有效地减小了误差。该方法可以去除背景干扰，得到清晰准确的色谱峰，比GC/MS法全扫描模式的灵敏度高，适合测定糖含量较低的植物组织。

表4 枸杞叶片与根系中的糖和糖醇含量(mg/g)Table 4 Contents of sugars and sugar alcohols in leaves and roots of Lycium chinensis (mg/g)

3 结论

本研究采用GC/MS法SIM模式快速分析测定乙酰糖和乙酰糖醇，以枸杞的根和叶片为例进行了准确的定量分析。为了避免乙酰化过程影响测定结果，选择核糖醇作为内标物进行定量分析，同时SIM模式降低了基质干扰、提高了灵敏度。该方法可为糖和糖醇类物质的检测提供参考依据。

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