百草枯中毒所致肺损伤的新药治疗研究进展

闫永吉，范亚丽，李 双，叶 俏

（首都医科大学附属北京朝阳医院职业病与中毒医学科，间质性肺疾病临床诊疗与研究中心，北京100020）

百草枯（paraquat，PQ）化学名称1，1’-二甲基-4，4’-联吡啶阳离子盐，是农业生产中广泛使用的一种非选择性触杀型除草剂，正常使用对人体无害。因误服或自服发生PQ中毒是全球严重的公共健康问题之一，死亡率高，尚无有效解毒剂［1］。PQ可经胃肠道、皮肤和呼吸道吸收，造成多脏器功能受损，其中PQ中毒主要引起急性肺损伤，并进展为肺纤维化，导致呼吸衰竭，甚至死亡［2］。

PQ致急性肺损伤的毒理学机制主要包括①氧化应激：PQ通过多胺摄取系统特异性地积累在肺，干扰机体氧化防御系统，触发细胞内氧化应激反应；②炎症反应：PQ诱导肺损伤过程中出现大量炎症细胞浸润，同时分泌多种促炎和促纤维化细胞因子，引起肺急性炎症和进展性纤维化；③肺纤维化：多种促纤维化细胞因子如转化生长因子（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、结缔组织生长因子、血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）等作用，激活相关信号通路如TGF-β1/Smad3和Notch1通路导致肺发生上皮间充质转化，肺纤维化形成；④补体活化：PQ中毒后，肺组织中C3a和C5a表达增加，募集和活化白细胞和内皮细胞，增强肺泡毛细血管通透性，上调黏附分子和细胞因子的表达，进而介导肺炎；⑤线粒体和DNA损伤：PQ进入细胞后可诱导线粒体内膜Ca2+依赖的渗透性增加，导致膜去极化、解耦联和基质肿胀，从而引起线粒体不可逆损伤，并可对DNA造成氧化性损伤，诱发细胞凋亡和基因表达异常，进而造成肺泡上皮细胞和血管内皮细胞功能受损［3-5］。随着对PQ诱导肺损伤机制研究的不断深化，针对上述靶点，本文综述抗氧化剂、免疫抑制剂和抗肺纤维化药物以及靶向治疗药物的研究进展。

1 抗氧化剂

体外实验表明，多种抗氧化剂，包括维生素、N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）和谷胱甘肽可减轻PQ诱导的脂质过氧化、炎症反应和细胞死亡，通过诱导抗氧化应激转录因子——核因子E2相关因子（nuclear factor erythroid like-2，Nrf2）的活化，上调抗氧化酶表达，保护机体免受PQ毒性损伤［6］。

经典的抗氧化剂维生素C和维生素E能清除PQ参与机体氧化还原循环生成的活性氧物质（reactive oxygen species，ROS），从而减轻肺氧化损伤。Moon等［7］在一项关于高剂量维生素C治疗急性PQ中毒疗效的回顾性研究中发现，与使用糖皮质激素（glucocorticoid，GC）和环磷酰胺静脉治疗的患者相比，同时接受高剂量维生素C（静脉滴注1 g，1 d后改为4 g，13 d）治疗2周的患者，发生PQ相关的急性肾损伤的比例显著降低；多变量回归分析表明，维生素C治疗可显著增加患者生存率［8］。但考虑到PQ在细胞内外环境中均可诱导ROS产生，维生素C和E的细胞膜渗透性低，对胞浆内ROS清除效果差，可能不是治疗PQ中毒理想的抗氧化剂［8］。

NAC是一种含巯基化合物，在体内脱乙酰基后变为半胱氨酸，进而参与还原型谷胱甘肽的合成，具有抗氧化作用。NAC可提高PQ中毒大鼠的存活率，使其腹腔注射绝对致死剂量从100 mg·kg-1增加到200 mg·kg-1，同时能降低血液中氧化应激损伤产物丙二醛和超氧阴离子的浓度，提高肺组织中谷胱甘肽浓度［9］。用脂质体型NAC预处理A549细胞后发现，与常规剂型相比，细胞内摄取的NAC水平更高，可明显抑制PQ诱导的细胞内谷胱甘肽的下降和ROS的合成，从而维持细胞正常的氧化还原状态［10］。此外，脂质体型NAC还可改善PQ诱导的线粒体膜电位下降，保护线粒体免受氧化损伤［10］。在PQ诱导组织损伤和氧化应激过程中，参与调节炎症和凋亡通路的蛋白质GDF15与p53基因活化相关的转录调节因子早期生长反应因子1和参与死亡诱导信号复合体合成的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶10均可被脂质体型NAC所抑制，从而维持细胞的内稳态。目前尚无临床研究证实NAC在PQ中毒致肺损伤中的治疗作用。

2 糖皮质激素和免疫抑制剂

GC和环磷酰胺具有抑制炎症反应的作用，通过ip给予不同剂量的环磷酰胺（1.5，15和30 mg·kg-1）干预PQ染毒大鼠，发现环磷酰胺剂量≥15 mg·kg-1时可通过改善肺组织超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性并降低血清TGF-β1的水平以减轻肺组织损伤［11］。同时，累积注射环磷酰胺有不良反应，包括肺损伤和出血性膀胱炎［11］。

鉴于PQ中毒患者中毒剂量和就诊时间的差异极大，GC和环磷酰胺对急性肺损伤的疗效在不同研究中得出的结果不一致，难以得到前瞻性随机对照试验（randomized controlled trial，RCT）证实，且剂量和疗程尚不明确。单中心回顾性研究显示，与既往接受高剂量环磷酰胺（每天2 mg·kg-1）和地塞米松（5 mg，每6 h 1次）治疗14 d的严重PQ中毒患者相比，更改治疗方案后患者的死亡率、全因死亡风险和死于肺纤维化相关的低氧血症事件均显著下降［12］。回顾性研究发现，将中到重度急性PQ中毒患者分为静脉GC治疗组和GC延长治疗组，2组患者均接受常规治疗，包括洗胃、导泻、补液、环磷酰胺（每天15 mg·kg-1，2 d）、利尿、血液灌流（1～3疗程持续3 h的活性炭血液灌流）及支持治疗，其中静脉GC治疗组给予甲泼尼龙每天15 mg·kg-1，持续3 d；GC延长治疗组在接受上述甲泼尼龙治疗方案后，每隔2 d GC剂量减半，直至减量至每天0.47 mg·kg-1，终止治疗。结果发现，GC延长治疗组病死率明显降低，白细胞减少发生率升高［13］。He等［15］纳入5项研究，其中3项RCT进行Meta分析。结果发现，与对照组相比，静脉免疫抑制治疗可以降低中度到暴发性PQ中毒患者的死亡率；疾病严重程度的亚组分析发现，暴发性PQ中毒组（2项RCT研究）2种治疗方案病死率无差异，中到重度PQ中毒组静脉免疫抑制治疗可降低患者死亡率。一项大样本急性PQ中毒RCT研究共纳入299例患者，分别比较了GC、免疫抑制治疗和盐水、安慰剂治疗的临床效果［14］。前者具体治疗方案为静脉给予甲泼尼龙（1 g·d-1，持续3 d）和环磷酰胺（1 g·d-1，持续2 d），随后口服地塞米松8 mg，每天3次，持续14 d。结果发现，GC和免疫抑制治疗不能降低PQ中毒患者住院病死率和治疗3个月后病死率［14］。

体外研究中，羟氯喹可保护A549细胞免受PQ诱导的细胞死亡，呈浓度依赖性，主要通过上调溶酶体相关膜蛋白1和2，以及自噬蛋白轻链3的表达，稳定溶酶体膜和上调自噬，发挥保护作用［16］。动物实验中，羟氯喹可显著降低PQ诱导的小鼠支气管肺泡灌洗液中白细胞计数、促炎细胞因子肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β水平以及肺组织内丙二醛和一氧化氮含量，增加超氧化物歧化酶的活性以及抗氧化蛋白Nrf2、血红素氧化酶-1和磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化还原酶-1的表达，进而减轻PQ诱导的小鼠肺损伤［16］。尚无羟氯喹用于PQ致急性肺损伤的临床报道。

多种促炎和促纤维化细胞因子参与PQ诱导肺损伤，伴随调节细胞凋亡、存活和增殖相关信号通路的活化，其中包括哺乳动物西罗莫司（雷帕霉素）靶蛋白〔mammalian target of sirolimous（Rapamycin），mTOR〕。mTOR是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，为磷脂酰肌醇激酶相关激酶蛋白质家族成员，调控细胞生长、增殖和存活。西罗莫司是mTOR高度特异性的强效抑制剂，具有抗炎、抗增殖和抗血管生成作用。西罗莫司可促进PQ染毒大鼠肺泡灌洗液中白细胞和中性粒细胞的凋亡，减弱促炎和抗凋亡转录因子NF-κB的活性，进而减轻肺炎症反应［17］。Xu等［18］研究显示，西罗莫司可通过活化Nrf2信号通路抑制转录因子Snail介导的上皮间充质转化，进而改善PQ诱导的肺纤维化病变。西罗莫司还可通过抑制Wnt/β连环蛋白信号通路下调Wnt1蛋白及其共同受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5和6的表达，进而减轻PQ诱导的A549和MRC-5细胞上皮间充质转化，减轻肺纤维化［19］。西罗莫司通过调节多种参与肺部炎症和纤维化形成的信号通路，减轻PQ诱导动物肺损伤，在PQ中毒治疗中具有潜在的价值。

3 抗肺纤维化药物

吡非尼酮（pirfenidone，PFD）是一种新型小分子化合物，具有抗纤维化、抗炎和抗氧化作用，用于治疗轻中度特发性肺纤维化，具有延缓肺功能下降的作用［20］。Seifirad等［21］比较了PFD和抗氧化剂对急性PQ染毒大鼠肺纤维化的治疗作用，发现与抗氧化剂组相比，第15天PFD组可显著减轻大鼠肺纤维化，但不能降低生存率。在舰船烟雾吸入性肺损伤大鼠模型中，PFD通过抑制氧自由基的产生和NF-κB或其他信号途径，诱导细胞因子如IL-6和TNF-α的合成与释放，减轻肺炎症反应［22］。类似地，PFD可通过抑制肺炎症和氧化应激，以及下调编码促纤维化细胞因子基因和参与ROS合成的相关酶基因的表达，减轻PQ介导的肺损伤和纤维化［23］。采用2种剂型的PFD（口服剂型组每天ig给予200 mg·kg-1，吸入剂型组每天吸入20 mg·kg-1，共14 d）干预PQ染毒大鼠肺纤维化模型，发现2种剂型的PFD治疗效果相似，均可降低肺氧化应激、炎症介质如TGF-β1和TNF-α水平，改善基质金属蛋白酶2与基质金属蛋白酶组织抑制物1的平衡，缓解肺纤维化病变［24］。每日吸入剂型PFD剂量远低于口服剂型，在临床治疗中可能是一种有希望的替代治疗方案。进一步比较泼尼松联合PFD治疗与PFD单用治疗在PQ诱导大鼠肺纤维化中的疗效，发现与对照组相比，2治疗组肺氧化应激及炎症介质TGF-β1和TNF-α水平明显下降，单独使用泼尼松并不能减轻肺纤维化病变，而PFD可显著减轻肺纤维化；当PFD联合泼尼松治疗时，肺组织病理炎症和纤维化病变较PFD单用组明显减轻［25］。目前尚无PFD用于PQ致肺损伤的临床报道。

尼达尼布（nintedanib）是一种小分子酪氨酸激酶抑制剂，靶向作用于参与特发性肺纤维化发生的生长因子受体，包括PDGF受体、成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor，FGFR）和血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR），阻断其信号转导通路发挥延缓疾病进展和肺功能下降速率的作用［26］。尼达尼布可减轻平阳霉素（博来霉素）和二氧化硅诱导肺纤维化动物模型的纤维化和肉芽肿病变［27］。PDGF，FGF和VEGF均参与PQ诱导动物肺纤维化的发病过程［28］，应用尼达尼布干预PQ中毒致肺纤维化具有一定的合理性。关于尼达尼布治疗PQ中毒的基础和临床研究有待开展。

4 潜在的靶向治疗药物

4.1 细胞因子拮抗剂

TNF-α是一种细胞毒细胞因子，可促进炎症反应和间充质细胞增殖分化，并通过与其他细胞因子的相互作用，直接或间接促进细胞外基质的合成，参与PQ介导的肺炎症和纤维化的发生。TNF-α拮抗剂有2种类型，一种是由TNF受体和IgG组成，依那西普是其代表药物，通过竞争性结合TNF-α发挥拮抗作用；另一种是抗TNF-α单抗，包括英利昔单抗（infliximab）、阿达木单抗（adalimumab）、戈利木单抗（golimumab）和赛妥珠单抗（certolizumab），直接中和TNF-α［29］，用于治疗骨关节疾病、自身免疫性疾病、部分感染和肿瘤等［30］。益赛普有效成分为重组人Ⅱ型TNF受体-抗体融合蛋白，干预PQ中毒大鼠肺纤维化模型，有助于减轻PQ诱导大鼠肺泡炎和肺纤维化程度，与下调TGF-β1/Smad信号转导通路相关［31］。据报道，皮下注射益赛普25 mg，每周2次，连用3周，配合甲泼尼龙和环磷酰胺治疗急性PQ中毒患者，有可能减轻肺纤维化［32］。

IL-6是一种多功能细胞因子，主要由巨噬细胞和单核细胞产生，可通过对其他细胞的旁分泌作用影响机体的炎症和纤维化反应。IL-6通过其受体和GP130发挥生物学效应。IL-6首先与IL-6受体的膜结合形式结合，诱导产生GP130的同源二聚体，从而形成高亲和力的IL-6、IL-6受体和GP130功能受体复合物。该复合物随后激活酪氨酸蛋白激酶通路进而调节细胞生长。ip给予PQ染毒小鼠重组可溶性GP130Fc以阻断IL-6信号转导通路后，PQ诱导肺损伤显著减轻［33］。

IL-17是一种促炎细胞因子，主要由Th17细胞、自然杀伤细胞和中性粒细胞产生，在多种炎症性疾病中具有重要作用。在肺炎症性疾病中，IL-17参与中性粒细胞募集至气道，诱导促炎细胞因子从肺毛细血管分泌至肺泡，同时可以活化NF-κB和P65促进炎症介质TNF-α和IL-6的转录和表达。应用IL-17中和性抗体干预PQ染毒小鼠，发现肺组织湿干重比和肺泡灌洗液中性粒细胞含量显著下降，血清IL-17，TNF-α和IL-6的水平降低，肺损伤缓解［34］。未来多种促炎细胞因子靶向抗体的联合治疗具有一定的临床前景。

TGF-β1是一种经典的促纤维化细胞因子，是肌成纤维细胞增殖、分化和细胞外基质合成的强烈刺激物，可刺激胶原基因的表达和胶原蛋白沉积，参与PQ诱导的肺纤维化的发生和发展。sc给予PQ染毒大鼠TGF-β1抗体，发现肺组织羟脯氨酸、TGF-β1和细胞外信号调节激酶及其磷酸化状态的表达显著降低，肺炎症和纤维化程度得到改善［35］。TGF-β1抗体可以通过抑制其下游细胞外调节蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路，改善PQ诱导肺损伤［35］。

4.2 补体抗体

补体系统在宿主防御和免疫稳态机制中起重要作用，但过度活化时可导致许多炎症性疾病和免疫性疾病，其生物学效应主要通过分裂产物C3a和C5a介导，在肺部炎症中C3a和C5a可以增加血管通透性，招募和激活白细胞与内皮细胞，上调黏附分子和细胞因子的表达。其中补体C5a可介导肺部炎症细胞浸润、氧自由基释放和细胞因子风暴参与PQ中毒诱导的肺损伤［5］。Sun等［36研究发现，中和性抗人类C5a抗体（IFX-1）可显著减轻PQ诱导的灵长类动物猴产生的系统性炎症反应和肺损伤；同时降低PQ中毒患者血浆中C5a活性；体外实验表明，IFX-1可以抑制PQ中毒患者血浆和健康志愿者外周血共同孵育后中性粒细胞表面黏附分子CD11b表达的升高，减轻中性粒细胞的活化和后续介导的炎症反应。

4.3 DNA酶Ⅰ

线粒体是PQ诱导机体氧化应激产生ROS的主要场所，也是PQ毒性作用的主要细胞器。由于ROS在线粒体的内膜产生，因此靠近内膜的线粒体DNA（mtDNA）容易遭受氧化损伤。体外研究发现，PQ损伤线粒体后可导致mtDNA释放，募集外周血单核细胞，刺激肺泡上皮细胞合成TGF-β1，进而介导肺炎症和纤维化。对PQ染毒小鼠预防或治疗性静脉注射DNA酶Ⅰ后，可明显降低病死率，第3天支气管肺泡灌洗液中炎症标志物总蛋白、TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显下降，第28天纤维化标志物Ⅰ型胶原含量也下降［37］。mtDNA可能是未来治疗PQ中毒的潜在靶点。

5 结语

综上所述，结合国内外基础和临床研究，针对PQ中毒所致肺损伤过程中氧化应激、炎症和肺纤维化、补体以及线粒体和DNA损伤，抗氧剂、免疫抑制剂、细胞因子抗体、抗肺纤维化药物、补体抗体和DNA酶均具有一定的治疗作用（表1）。但PQ急性中毒的临床救治依旧是一个难题，毒理学和人体内毒代动力学研究的不断深化是推动其治疗学发展的基础。PQ中毒诱导急性肺损伤和肺间充质纤维化的机制十分复杂，各种途径相互交叉，协同促进肺损伤。目前尚缺乏有效的解毒剂，单一治疗措施疗效甚微，早期、综合治疗尤为重要，包括清除毒物、药物治疗、脏器支持和肺移植。未来药物治疗方面依旧面临巨大挑战，摄入的PQ何时能完全从体内清除，停止对靶器官如肺损伤尚未完全阐明，且不同服毒剂量所造成的器官损伤和进程具有个体差异。因此，治疗药物的剂量、疗程、联合用药以及临床疗效评价指标均有待深入研究。同时，也应当加强基础与临床研究之间的交流和合作，促进药物治疗基础研究成果的转化和应用。

表1 百草枯中毒所致肺损伤新药研究一览表