川芎嗪对神经病理性疼痛模型大鼠的镇痛作用及对脑中枢敏化区氨基酸类神经递质含量的影响

张美玉，焦 玥，刘 洋，李玉娟，赵小亮，李 涛

（中国中医科学院医学实验中心，北京市中医药防治重大疾病基础研究重点实验室，北京100700）

神经病理性疼痛（neuropathic pain，NPP）为临床上多见的慢性顽固性疼痛，是以自发性疼痛、痛觉过敏及痛觉超敏为主要症状的综合征。引起神经痛的因素很多，如外伤、压迫、炎症、代谢障碍及基因表达异常等［1］。在一般人群中NPP患病率高达6%～8%，而在糖尿病患者中高达20%～24%，在年龄≥50岁的带状疱疹患者中，25%～50%患者在疱疹愈合3个月后会发展为带状疱疹后神经痛［2-3］。NPP病程较长，严重影响患者的生活质量、情绪和社会功能，一直是基础和临床医学研究的焦点［4］。

NPP发病机制包括外周和中枢2部分。外周机制包括外周游离神经末梢的微环境改变、外周神经受损区或背根神经节神经元异位放电、肾上腺素能α受体表达增多和交感神经发芽等［5］。中枢机制包括脊髓背角痛觉神经元敏化、胶质细胞激活、突触传递效率长时程增强、脑部高位中枢敏化（central sensitization）和中枢下行易化系统的激活等［6-7］。越来越多的学者认为，中枢敏化较之外周敏化对NPP的产生和维持具有更重要的作用。

氨基酸类递质是中枢神经系统（central nervous system，CNS）中与疼痛密切相关的一类神经递质。大量研究表明，外周神经损伤后，伤害性刺激通过A纤维和C纤维到达脊髓背角，该部位的神经突触及胶质细胞释放大量的兴奋性氨基酸，包括谷氨酸（glutamate，Glu）和天冬氨酸（aspartic acid，Asp），而抑制性氨基酸如甘氨酸（glycine，Gly）和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）释放减少［8-9］。Glu在大脑皮质、海马和脊髓灰质中含量较高，根据电生理和药理学研究，Glu受体分为离子型和代谢型2类，离子型Glu受体分为N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR）、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸受体（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-isopropanoic acid receptor，AMPAR）和海人藻酸受体［10］；而代谢型Glu受体（metabotropic glutamate receptor，mGluR）分 为mGluR 1/5，mGluR 2/3和mGluR 4/6/7/8 3类［11-12］。Glu激活其受体产生的兴奋毒性和抑制细胞膜上Glu/胱氨酸转运体所产生的氧化毒性，在疼痛发病过程中发挥重要作用［10，13］。研究发现，前扣带回皮质区对动物神经损伤产生的厌恶和恐惧行为有正向作用，电刺激该区导致动物自残行为加剧，这可能是刺激该区产生了对疼痛的记忆反应［14］。另外，杏仁核在NPP的感觉尤其是情感痛苦方面发挥着重要作用［15］。目前，国内外对NPP发病机制的研究多集中在脊髓水平，而少见脑水平的研究报道。因此，本研究以脊髓上疼痛信号传导和体验的关键区域——杏仁核和前额叶皮质（medial prefrontal cortex，mPFC）作为研究位点，考察NPP模型大鼠该脑区内氨基酸类神经递质的动态变化。

近年来，针对NPP发病机制进行中药单体或复方的研究较多。临床常用中药川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）具有活血行气、祛风止痛之功。川芎嗪（ligustrazine）是川芎的主要活性成分之一，易溶于石油醚、氯仿和稀盐酸等。目前，其在临床主要用于治疗心脑血管疾病，而在其他方面的研究和应用报道较少。文献报道，川芎石油醚提取部位具有较强的镇痛作用［16］，提示川芎中具有镇痛效应的活性成分可能是川芎嗪。本研究基于前期工作基础［17-19］，拟采用更符合NPP病理机制且稳定的大鼠坐骨神经部分损伤（spared sciatic nerve injury SSNI）模型，通过行为学方法观察川芎嗪对NPP的干预作用；应用颅内双位点微透析（intracranial dualprobe microdialysis）技术，结合高效液相-荧光检测法，观察川芎嗪对mPFC和杏仁核中央核（central，nucleus of the amygdaloid，CeA）细胞外液中Glu，Asp，Gly和GABA含量的影响，探讨川芎嗪的镇痛机制，为扩大川芎嗪临床适应证提供新的科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD大鼠，体质量180～200 g，购于中国食品药品检定研究院，合格证号为SCXK（京）2014-0013。大鼠饲养于中国中医科学院医学实验中心。室温20～24℃，相对湿度40%～55%，光照12 h∶12 h，定时喂养，自由饮水。

1.2 药品、试剂和仪器

盐酸川芎嗪（批号：A0189，四川成都曼思特生物科技有限公司）。51000-20C纤维丝痛觉测试包（von Frey hair，美国Danmic公司）；冷敷喷雾剂（美国Cramer公司）；特美汀（批号：60230es07，上海前尘生物科技公司）；Glu（批号：G1251）、GABA（批号：A2129）、Asp（批号：A8949）、Gly（批号：94119）、辛烷磺酸钠和乙酸钠（美国Sigma公司）；硼酸（美国ACKOS Organics公司）；β-巯基乙醇（美国Amresco公司）；邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA，美国Aldrich公司）；四氢呋喃（美国Mallinckrodt Baker公司）；磷酸、乙酸和甲醇（色谱级，迪马科技公司）EDTA和KH2PO4（北京化工厂）。

液相检测系统：高效液相色谱（德国SykamGmbH 公司）、Clarity Lite 色谱工作站（荷兰Antecleyden公司）、RF-10AXL 荧光检测器（日本岛津公司）和Eclipse AAA 荧光检测色谱柱（4.6 mm ×150 mm，5 μm，美国Agilent 公司）。SHB-ⅢA 循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；KQ-1000 超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司）；arium 61316 反渗透纯水系统和PB-21 pH 计（德国Sartorius 公司）；水相和有机相微孔滤膜（天津津腾公司）；STRONG8003 立体定位仪、69001动物体温维持仪和90-102 手持式颅钻（深圳瑞沃德公司）；玻璃离子体水门汀（上海医疗器械股份有限公司）。微透析系统：CMA/11 探针（膜长：1 mm，膜直径：0.5 mm，截留量：20 ku）、CMA/12 探针（膜长：2 mm，膜直径：0.5 mm，截留量：60 ku）及套管、CMA/402 微量注射泵和CMA/470 低温样品自动收集器（瑞典CMA Microd AB 公司）；五通转环清醒活动装置（美国Instech 公司）。

1.3 动物分组、给药和行为学检测

1.3.1 大鼠坐骨神经部分损伤模型的制备和筛选

大鼠适应性饲养3 d后，连续3 d每天1次采用纤维丝机械刺激法［20］和冷喷法［21］观察大鼠机械缩足反射和冷痛敏反应，其中机械缩足痛阈值＞26 g和冷痛敏评分为0者视为痛觉正常大鼠，将其随机分为SSNI手术组和假手术对照组。依据Decosterd等［22］报道的方法，大鼠吸入异氟烷（2.0%，流量0.5L·min-1）麻醉。将SSNI组大鼠左后肢的股骨大转子与膝关节之间沿着臀大肌纤维方向做1 cm皮肤切口，梨状肌下暴露坐骨神经，用玻璃分针钝性分离坐骨神经分支中的胫神经和腓总神经，用棉线紧紧结扎，在远心端剪断，保留腓肠神经，分层缝合肌肉和皮肤。假手术组不做神经的结扎和剪断。大鼠造模后第7～9天，连续3 d测试机械痛缩足反射和冷痛敏反应，筛选出机械痛阈＜4 g和冷痛敏评分＞2的大鼠，即SSNI模型大鼠。

1.3.2 NPP行为学检测

机械痛敏采用纤维丝机械刺激评价法（同1.3.1），以不同克数的纤维丝刺激大鼠左后足足底外侧，观察是否出现缩足反应。以刺激5次中大鼠缩足达3次时的纤维丝最小克数值认定为机械痛阈响应值。机械痛阈采用镇痛活性作为评价指标，镇痛活性（%）=〔（给药后不同时间点机械痛阈响应值-给药前基础值）/（手术前基础值-给药前基础值）〕×100%。冷痛敏测试采用冷喷法，即用冷敷喷雾剂快速（1 s）准确定位喷涂在左后足足底外侧表面，根据冷刺激后的缩足反应进行评分。痛敏异常的评分标准为：无异常反应为0分；大鼠惊吓反应轻微，或轻微抬起受刺激的后肢（3 s内落下）为1分；脚掌迅速抬起＞3 s，搔摇受刺激的后爪为2分；持续或反复抬起受刺激的后肢并舔爪、摇爪或大叫，并表现出厌恶、烦躁的反应为3分。

1.3.3 SSNI模型大鼠的分组和药物处理

SSNI模型大鼠随机分为模型组和川芎嗪组，川芎嗪组大鼠于术后第10天分别采用鞘内（intrathecal，it，25 μmol·kg-1）、丘脑腹后外侧核（ventral posterior lateral nucleus of thalamus，VPLNT，2.5 μmol·kg-1）和静脉（intravenous，iv，20 mg·kg-1）注射3种不同的方式给药。其中it注射位点为大鼠双侧髂前上棘连线中点旁开5 mm处，沿45℃倾斜刺入脊髓腔，注射体积为60 μL·kg-1；iv注射采用尾静脉注射，注射体积为2 mL·kg-1；VPLNT给药组则需要在术后第8天进行大鼠VPLNT（前卤后2.6 mm，中缝旁开3.0 mm，垂直进针5.0 mm）埋入套管（该手术与双位点套管植入术同步进行），以此作为注射给药位点，注射体积为2 μL·kg-1。各组分别在注射给药前（0 min）、及给药后30，60，90，120，180和240 min观测大鼠的机械痛阈和冷痛敏行为的变化。

1.4 高效液相-荧光色谱法检测大鼠脑mPFC和CeA内氨基酸类神经递质含量

1.4.1 大鼠颅内双位点微透析同步采样

大鼠SSNI造模、筛选和分组给药同1.3，每组8只。造模手术后第8天，大鼠吸入2.0%异氟烷（流量0.5 L·min-1）麻醉，在立体定位仪导引下，分别于大鼠mPFC（前卤前2.7 mm，中缝旁开1.8 mm，进针2.5 mm，右外侧倾斜20℃）和CeA（前卤后2.3 mm，中缝旁开4.0 mm，进针7.4 mm）内埋入探针套管，用牙科水泥固定。术后第9天21∶00～24∶00，大鼠在吸入异氟烷的麻醉状态下插入2个探针，并用胶布固定。其中膜长1 mm的探针插入CeA的套管中，膜长2 mm的探针插入mPFC的套管中（图1）。将大鼠放在可自由活动的装置（33 cm×40 cm×36 cm）内，用改良的Ringer溶液灌流2条探针通路过夜，流速为0.3 μL·min-1。次日6∶30，将流速调为1.3 μL·min-1，平衡1.5 h后开始收集透析液。每20 min收集1管，收集体积为26 μL，共收集80 min，作为给药前基础水平。而后分别采用VPLNT，it和iv注射给予川芎嗪，并以同样的收集体积和频率连续收集透析液至220 min。以观察药物对透析液中神经递质的影响。

Fig.1 Illustration of dual-probe microdialysis targets in medial prefrontal cortex（mPFC）and central nucleus of the amygdaloid（CeA）of rat brain.Probes（the grey area indicates probe membrane，the black area indicates probes shaft）in mPFC occupied prelimbic and cingulate cortex.

1.4.2 体外回收率测定

不同膜长探针在使用前分别放置于含有Glu，Asp，Gly和GABA的混合标准液中，在室温条件下，用改良的Ringer溶液以1.3 μL·min-1的流速灌流，平衡30 min后开始收集透析液，每管收集20 min，共收集4管。以不同氨基酸类神经递质的探针体外回收率来折算其在脑微透析液中的浓度。探针体外回收率（%）=透析液中某递质浓度均值/混合标准液中该递质浓度均值×100%。

1.4.3 高效液相-荧光色谱法检测大鼠脑透析液中Glu，Asp，Gly和GABA含量

色谱分析条件：将OPA 5 mg溶于甲醇120 μL中，加入β-巯基乙醇10 μL和硼酸缓冲液（0.2 mol·L-1pH 9.2）1 mL，混匀，配制成衍生液存放于暗处备用。A液：缓冲液（20mmol·L-1乙酸钠溶液，pH7.2）∶甲醇∶四氢呋喃（V∶V∶V）=400∶95∶5；B液：缓冲液∶甲醇（V∶V）=120∶380。流速：0.8mL·min-1；光电倍增管：12；柱温：40℃。梯度洗脱：0～10 min为0%～63%B液；10～12 min为63%B液；12～17 min为100%B液；17～18 min为100%～0%B液；18～21 min为0%B液。OPA柱前自动衍生，分离后的氨基酸衍生化合物用荧光检测器进行检测，激发波长为340 nm，发射波长为455 nm。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 川芎嗪对SSNI大鼠痛敏行为的影响

2.1.1 SSNI大鼠造模前后机械痛阈和冷痛敏的变化

SSNI模型组大鼠手术后机械痛阈显著降低（P＜0.01，图2A），冷痛敏评分显著升高（P＜0.01，图2B）。假手术组手术前后2项指标均无明显差异。提示SSNI大鼠模型复制成功。

Fig.2 Evaluation of mechanical withdraw threshold（A）and cold spray scores（B）before and after spared sciatic nerve injury（SSNI）in rats.Rats were tested at pre-surgery and the 7th-9thday post-SSNI.，n=7.＊＊P＜0.01，compared with pre-surgery.

2.1.2 川芎嗪it注射对SSNI大鼠机械痛阈和冷痛敏的影响

与SSNI模型组相比，it注射川芎嗪25 μmol·kg-1对SSNI大鼠机械痛镇痛活性和冷痛敏评分无明显缓解作用（图3）。

2.1.3 川芎嗪VPLNT注射对SSNI大鼠机械痛阈和冷痛敏的影响

与SSNI模型组相比，VPLNT注射川芎嗪2.5 μmol·kg-1后30～90 min可明显降低冷痛敏评分（P＜0.05，图4B），在其他检测时间点对冷痛敏评分的影响无统计学差异；而给药后各时间点对机械痛镇痛活性均无明显缓解作用（图4A）。

2.1.4 川芎嗪iv注射对SSNI大鼠机械痛阈和冷痛敏的影响

与SSNI模型组比较，iv注射川芎嗪20 mg·kg-1后60 min可明显升高SSNI大鼠机械痛镇痛活性（P＜0.05，图5A），而在注射后60～120 min SSNI大鼠冷痛敏评分明显降低（P＜0.05，图5B）。

2.2 川芎嗪对SSNI大鼠mPFC和CeA细胞外液中氨基酸递质含量的影响

2.2.1 川芎嗪对Glu含量的影响

如图6A1所示，与假手术组相比，SSNI模型组大鼠mPFC细胞外液中Glu含量显著升高（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组相比，VPLNT注射川芎嗪2.5μmol·kg-1后20～180min、it注射川芎嗪25μmol·kg-1后20～100 min及iv注射川芎嗪20 mg·kg-1后20～140 min均显著降低mPFC细胞外液中Glu的含量（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.3 Analgesic effects of ligustrazine（Lig，25 μmol·kg-1）intrathecal（it）injection in SSNI rats by mechanical withdraw threshold test（A）and cold spray test（B）.On the 10thday after the SSNI operation，rats were individually injected saline or Lig.The mechanical withdraw threshold and cold spray scores were observed before（0 min）or after 30，60，90，120，180 and 240 min of Lig it administration，respectively.The mechanical withdraw threshold was evaluated by analgesic activity.Analgesic activity（%）=［（mechanical withdraw threshold value at different points after Lig injection-mechanical withdraw threshold value before Lig injection）/（mechanical withdraw threshold value of pre-surgery-mechanical withdraw threshold value before Lig injection）］×100%.Cold pain sensitivity was tested by cold spray，and cold spray scores were evaluated with 0，1，2 and 3 degree according to the retraction reaction level of rats after cold stimulation.x±s，n=7.

如图6A2所示，SSNI模型大鼠CeA细胞外液中Glu含量比假手术组升高，给药前及给药后60～100 min升高具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，iv给予川芎嗪20 mg·kg-1后60～140 min显著降低大鼠CeA细胞外液中Glu的含量（P＜0.05，P＜0.01），而VPLNT和it注射后均未见明显差异。

2.2.2 川芎嗪对Asp含量的影响

如图6B所示，与假手术组相比，SSNI模型大鼠mPFC和CeA细胞外液中Asp含量有升高趋势，但无统计学差异。与模型组相比，VPLNT注射川芎嗪2.5 μmol·kg-1后60～100 min和180 min及it注射川芎嗪25 μmol·kg-1后100～180 min均明显降低mPFC细胞外液Asp的含量（P＜0.05，P＜0.01）。而iv注射川芎嗪20 mg·kg-1后60 min明显降低CeA细胞外液Asp的含量（P＜0.05），而it和VPLNT注射川芎嗪后均未降低CeA细胞外液中Asp的含量。

Fig.4 Analgesic effects of ligustrazine（2.5 μmol·kg-1）ventral posterior lateral nucleus of thalamus（VPLNT）injection in SSNI rats by mechanical withdraw threshold test（A）and cold spray test（B）.See Fig.3 for the rat treatment.，n=6.＊P＜0.05，compared with model group.

Fig.5 Analgesic effects of ligustrazine（20 mg·kg-1）intravenous（iv）injection in SSNI rats by mechanical withdraw threshold test（A）and cold spray test（B）.See Fig.3 for the rat treatment.x±s，n=8.＊P＜0.05，compared with model group.

2.2.3 川芎嗪对Gly含量的影响

如图6C所示，与假手术组相比，SSNI模型组大鼠mPFC和CeA细胞外液中Gly含量显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。与模型组相比，3种途径注射给予川芎嗪后0～220 min均明显降低mPFC和CeA细胞外液中Gly的含量（P＜0.05，P＜0.01）。

2.2.4 川芎嗪对GABA含量的影响

各组大鼠mPFC和CeA细胞外液GABA含量均未见明显差异（图6D）。

3 讨论

中枢敏化是指脊髓及脊髓上痛觉相关神经元的兴奋性异常升高或突触传递增强。外周神经损伤后，伤害性刺激通过A纤维和C纤维到达脊髓背角，该部位神经突触释放大量的Glu。Glu是CNS最重要的兴奋性氨基酸类神经递质，大部分位于胞内，跨膜浓度梯度大约几千倍。由于CNS中不存在特异性Glu代谢酶，神经细胞内外Glu平衡主要依赖神经元和胶质细胞膜上高亲和力的Glu转运体的重摄取来维持。一旦摄取受到抑制，几秒钟内就会引起胞外和突触间隙Glu大量蓄积，突触后膜上特异性结合受体NMDAR和AMPAR被高度激活，引起大量Ca2+内流。细胞间隙Glu如果长期处于高浓度状态，致使胞内Ca2+离子超载最终将导致神经元坏死［23-24］。长期持续地兴奋脊髓及其上位中枢（皮质和丘脑），可使CNS发生可塑性变化。这一过程即经典的NMDAR介导兴奋性毒性效应引发中枢敏化现象。

Fig.6 Effect of ligustrazine on extracellular contents of glutamate（Glu，A），aspartic acid（Asp，B），glycine（Gly，C）and γ-aminobutyric acid（GABA，D）in medial prefrontal cortex（mPFC）and central nucleus of amygdaloid（CeA）in SSNI rats by high performance liquid chromatography-fluorescence detector.After 80 min of basic perfusion，rats of each group were perfused with the Ringer′s solution for 220 min.The rats of Lig groups were administered with 2.5 μmol·kg-1 through VPLNT，25 μmol·kg-1through it，and 20 mg·kg-1through iv injections.Dialysate samples were taken continuously 220 min after ligustrazine administration.x±s，n=8.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with sham group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

由NMDAR触发的Glu神经传递的突触后活动需要3个条件同时存在，分别为①Glu占据了NMDAR结合位点；②Gly或内源性配体D-丝氨酸与NMDAR上的结合位点结合；③神经元发生去极化，去除镁离子的阻塞作用，开放离子通道以允许Ca2+进入神经元。当NMDA-Ca2+通道开放时，由NMDAR介导的一些重要信号包括长时程增强效应、突触可塑性和中枢兴奋性毒性信号系统被激活［25］。

杏仁核和mPFC区作为脊髓上疼痛信号传导和体验的关键区域，与疼痛相关的认知、情绪的产生和调控密切相关。本研究采用动物行为学和颅内双位点微透析结合高效液相-荧光色谱法动态观察NPP模型大鼠两脑区（mPFC和CeA）细胞外液中兴奋性和抑制性氨基酸神经递质含量的变化。结果显示，与假手术组相比，SSNI模型组大鼠机械痛阈值显著降低，而冷痛敏评分显著升高；mPFC和CeA细胞外液中Glu和Gly含量均显著升高；而mPFC和CeA细胞外液中GABA/Glu比值有降低趋势。本研究结果表明，SSNI大鼠造模前后疼痛关联的行为发生显著变化，其敏化中枢脑区Glu和Gly水平也发生了显著改变，提示大鼠SSNI模型可作为研究神经痛较理想的动物模型。另外，在Glu系统实现其生理功能和病理基础的过程中，Asp伴随Glu升高也有同步增加的趋势，而抑制性神经递质Gly和GABA并未显著降低，而是明显升高或有升高趋势。这可能是机体为了维持兴奋性和抑制性递质之间动态平衡而做出的应激调控反应。

本课题组根据NPP病理机制特征、辨证选药及临床疗效的筛查，发现临床常用药川芎嗪在治疗NPP方面可能具有应用价值。川芎嗪在川芎药材中的含量11～49 μg·g-1不等，差异很大，是川芎的主要有效活性成分之一，现可人工合成［26］。为了进一步研讨川芎嗪的镇痛活性，本课题组采用3种给药方式，对川芎嗪药效学和初步作用机制进行研究。结果显示，川芎嗪iv注射后能明显降低SSNI大鼠的机械痛阈，改善冷痛敏评分；而VPLNT和it注射后具有缓解机械痛阈和冷痛敏作用的趋势，这可能与川芎嗪用药剂量偏低有关。而微透析实验结果显示，川芎嗪通过VPLNT，it和iv注射均能显著抑制SSNI大鼠mPFC细胞外液Glu，Asp和Gly的水平，降低CeA细胞外液Glu和Gly的水平。在川芎嗪3种给药方式中，以iv注射镇痛作用最明显。

川芎嗪镇痛作用可能通过抑制大鼠mPFC和CeA脑区兴奋性氨基酸递质释放，调控兴奋性和抑制性氨基酸递质的动态平衡，对兴奋性毒性效应造成的神经元损伤发挥一定的保护作用。因此，深入研究川芎嗪对NPP大鼠的治疗作用及其机制具有重要的临床应用价值，将为川芎嗪“老药新用”提供新的科学依据。