伐瑞拉地在稳定兔动脉粥样硬化斑块中的作用及其可能机制

范存静 邱敬涛 张晓光 卢学峰

郑州大学第二附属医院超声科（郑州 450014）

随着人们物质生活的改善，心、脑血管疾病的发生率越来越高，已经成为中老年人的主要死亡原因之一［1-2］。大量研究［3］显示，动脉粥样硬化是心、脑血管疾病的独立危险因素，斑块破裂继发血栓形成则直接导致了急性心肌梗塞、急性脑梗、缺血性脑卒中等疾病的发生［4］。有研究显示，伐瑞拉地（Varespladib）具有减轻大鼠动脉粥样硬化损害的作用，但对兔动脉粥样硬化的作用未见报道。本研究首次观察Varespladib对兔颈动脉粥样硬化斑块的作用，目的是为临床开发新型降血脂药物提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康雄性大白兔20只，平均体重（2.4±0.5）kg，月龄2～3个月，购于郑州大学实验动物中心。

1.2 仪器与试剂采用带UE功能的HITACHI Preirus彩色超声仪，探头频率5～13 MHz。高敏C反应蛋白（hs⁃CRP）、肿瘤坏死因子⁃α（TNF⁃α）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL⁃C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL⁃C）检测试剂盒均购自郑州安塞生物科技有限公司；巨噬细胞CD68检测试剂盒购自美国Sigma公司；球囊导管（直径2.5 mm）购自深圳朗医科技有限公司；全自动低温离心机购自上海艾测电子科技有限公司。

1.3 分组及模型制备将20只大白兔用普通饲料喂养1周后，随机将其分为实验组和对照组，每组各10只。两组均采用4F Forgaty球囊导管行颈动脉内膜损伤术。术后对照组仅给予高脂饲料喂养（1%胆固醇、4%猪油、10%蛋黄粉和85%普通饲料）；试验组给予高脂饲料的同时还给予Varesp⁃ladib（30 mg/kg）。

1.4 实验方法两组在第18周时均经兔耳缘静脉取血采用酶联免疫吸附法（Elisa试剂盒）检测hs⁃CRP、TNF⁃α和血脂情况（TC、HDL⁃C、LDL⁃C），同时两组均行颈动脉超声检查，运动弹性成像技术［5］对颈动脉斑块进行评分，将其分为稳定斑块（弹性评分≥3分）和易损斑块，即不稳定斑块（弹性评分＜3分）。取血后处死动物，分离颈总动脉，并进行固定、包埋、切片和HE染色。每组选取10个高倍镜视野，运用免疫组织化学染色技术检测巨噬细胞CD68的阳性细胞数表达情况。

1.5 统计学方法统计软件应用SPSS 17.0，所有数据均用均数±标准差表示，定量资料采用非参数检验，定性资料采用χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组颈动脉斑块的超声检查结果试验组共检出颈动脉斑块69个，其中稳定斑块48个，易损斑块21个；对照组共检出颈动脉斑块138个，其中稳定斑块35个，易损斑块103个，两组结果比较，差异有统计学意义。试验组斑块面积占管腔总面积的百分比为（25.07±7.31）%，对照组斑块面积占管腔总面积的百分比为（39.24±9.52）%。两组比较差异有统计学意义。见表1、表2、图1。

表1 两组不同类型颈动脉斑块数量的比较Tab.1 The number of the two different types of carotid artery plaques in the two groups 个（%）

图1 颈总动脉斑块的超声弹性成像表现Fig.1 The elasticity imaging of the two types of carotid artery plaque

表2 两组斑块面积占管腔总面积的百分比Tab.2 The percentage of plaque area in total lumen area±s

表2 两组斑块面积占管腔总面积的百分比Tab.2 The percentage of plaque area in total lumen area±s

组别试验组对照组Z值P值斑块面积占管腔总面积的百分比（%）25.07±7.31 39.24±9.52 8.842 0.001

2.2 Varespladib对炎症因子及血脂水平的影响试验组与对照组血清炎症因子比较，hs⁃CRP及TNF⁃α均降低，其中hs⁃CRP显著降低且差异有统计学意义（Z=3.780，P＜ 0.001），而TNF⁃α仅轻度降低，差异无统计学意义（Z=1.965，P=0.050）；试验组与对照组血脂水平比较，TC、HDL⁃C及LDL⁃C均有所降低，其中LDL⁃C降低明显且差异有统计学意义（Z=3.780，P＜0.001）；而TC和HDL⁃C仅轻度降低，差异无统计学意义（Z=1.475，P=0.140；Z=1.361，P=0.173）。见表3。

表3 两组炎症因子及血脂水平的比较Tab.3 The level of inflammatory factors and blood lipids in the two groups ±s

表3 两组炎症因子及血脂水平的比较Tab.3 The level of inflammatory factors and blood lipids in the two groups ±s

组别试验组对照组Z值P值hs⁃CRP（mg/L）5.56±0.41 16.34±0.44 3.780 0.001 TNF⁃α（mg/L）55.25±0.62 55.98±0.98 1.965 0.050 TC（mmol/L）15.19±0.99 15.91±0.64 1.475 0.140 HDL⁃C（mmol/L）0.91±0.14 1.05±0.24 1.361 0.173 LDL⁃C（mmol/L）5.42±0.62 15.71±0.60 3.780 0.001

2.3 正常颈动脉管壁、颈动脉稳定斑块及易损斑块的病理表现图2A为正常颈动脉管壁，管壁层次清晰，内膜光滑平整；图2B为稳定斑块，可见凸向管腔的连续性斑块，内膜中可见泡沫化巨噬细胞和平滑肌细胞；图2C为易损斑块，可见内膜表面不光滑，不连续，并有血栓附着。

图2 正常颈总动脉壁及不同颈动脉斑块的病理表现（HE，×400）Fig.2 The pathology of normal carotid artery wall and the different types of carotid artery plaque（HE，× 400）

2.4 两组颈动脉斑块内巨噬细胞CD68的表达情况对照组巨噬细胞CD68的阳性表达数为（73.50±5.32）个/HP，试验组巨噬细胞CD68的阳性表达数为（45.30±4.52）个/HP，试验组巨噬细胞CD68的阳性表达数明显少于对照组（Z=3.785，P＜0.001）。见图3。

图3 两组颈动脉斑块内巨噬细胞CD68的免疫组化结果（SP，×100）Fig.3 The immunohistochemical effects of CD68 on the macrophages in the two types of carotid artery plaque（SP，×100）

3 讨论

动脉粥样硬化是一种由多因素介导的累及全身多个系统、器官的疾病［6］，动脉粥样硬化易损斑块可以形成表面溃疡、斑块破裂并继发血栓形成，导致急性心、脑血管疾病［7］。磷脂酶A2是一种钙离子依赖性磷脂酶，被激活后可以促使LDL⁃C升高，产生大量生物活性物质，并通过炎症因子激活血管壁中的促动脉粥样硬化通路，形成斑块［8］。磷脂酶A2中只有可溶性磷脂酶A2能够促进LDL⁃C的转移，但几乎所有的磷脂酶都能够与LDL⁃C结合，形成动脉粥样硬化微颗粒［8］。因此，抑制磷脂酶的功能对减轻动脉粥样硬化的程度具有重要的作用。

Verespladib是一种新型的非选择性磷脂酶A2抑制剂，其对磷脂酶的抑制范围较广。Verespladib与传统的、以降脂为目的的他汀类药物不同，传统的他汀类药物能降低LDL及hs⁃CRP水平，能够直接或间接的抑制炎症反应，但对磷脂酶的作用很小。Verespladib作为一种磷脂酶A2抑制剂能够特异的与磷脂酶A2结合，抑制其活性，进而抑制由其介导的一系列炎症反应。本研究结果显示，试验组中斑块的检出数量明显少于对照组，且稳定斑块的数量明显多于对照组，稳定斑块的弹性分值也高于易损斑块，说明Verespladib具有显著的抗动脉粥样硬化，增强斑块稳定性的作用。这与HURT⁃CAMEJO等［9］在小鼠身上进行的研究结果基本一致。本研究中试验组hs⁃CRP表达量、LDL⁃C的含量均显著低于对照组，这与传统的他汀类药物的疗效一致，Verespladib通过不同的途径达到了同样的效果。巨噬细胞在动脉粥样硬化的进展中具有重要的作用，活化的巨噬细胞能够吞噬LDL⁃C进而形成泡沫细胞，大量泡沫细胞聚集在斑块的纤维帽中，加上其他脂质和细胞使纤维帽的张力增加，厚度变薄，稳定性变弱，容易破裂［10-11］。本研究通过免疫组化技术检测巨噬细胞表面的特异性抗原CD68，结果显示，试验组中巨噬细胞CD68的阳性表达量明显少于对照组，而且试验组中斑块面积占管腔总面积的百分比明显低于对照组，这说明Verespladib可以通过减少动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的数量来减小斑块的面积，抑制斑块的进展，从而增加斑块的稳定性［12-13］。

综上所述，Verespladib在抗动脉粥样硬化及增加易损斑块稳定性的过程中具有重要的作用，虽然国外有研究［14-16］发现Verespladib能增加心血管事件的发生率，但基于其显著的降血脂作用，还需对其进行更深一步的研究，或者考虑联合用药，通过动物实验和大规模临床试验来验证其疗效。

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