整合素αvβ3拮抗剂HYPOO23对耐药神经胶质瘤细胞U251凋亡的影响

吕帅 王艳林 刘彦廷 蔡宏新 艾文兵

1宜昌市夷陵医院（湖北宜昌 443100）；三峡大学 2医学院，3第一临床医学院（湖北宜昌 443000）

胶质瘤是中枢神经系统较常见的恶性肿瘤，存在高复发率和高病死率的特点。术前或术后化疗是治疗胶质瘤，提高患者生存时间的主要方法之一。然而，化疗药物对胶质瘤的治疗效果不理想；尤其是经过多次化疗后，化疗药物治疗效果明显比之前差。而胶质瘤细胞耐药是胶质瘤化疗效果不理想的主要原因之一。因此，提高肿瘤细胞对药物的敏感性成为提高化疗效果的研究热点。

近来研究发现，肿瘤细胞的耐药性与整合素密切相关［1-3］。但整合素拮抗剂能否提高化疗药物对耐药胶质瘤细胞的治疗效果，还需深入的研究。本研究通过整合素αvβ3拮抗剂处理耐药神经胶质瘤细胞后，观察神经胶质瘤细胞的凋亡及耐药蛋白表达量的变化，探讨整合素拮抗剂使耐药神经胶质瘤对化疗药物的敏感性产生影响及可能的机制，以期为提高化疗药物对耐药胶质瘤的治疗效果提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料神经胶质瘤U251细胞系：武汉大学细胞典藏中心；整合素拮抗剂HYP0023：购于Med⁃chem Express（MCE）公司；替莫唑胺购于圣克鲁斯生物技术公司；Annexin V⁃FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购于Bender Medsystems公司；DMEM高糖培养液（英杰公司）；MGMT、P⁃gp、MRP和GST（圣克鲁斯生物技术公司）。

1.2 MTT法检测U251TR细胞的培养及HP0023对U251TR的抑制率本研究使用替莫唑胺溶液浓度递增［4］的方法，诱导神经胶质瘤U251细胞，使其对替莫唑胺产生耐药，并形成对替莫唑胺具有稳定的耐药性，这样的耐药胶质瘤细胞株命名为U251TR。诱导的药物作用浓度梯度为0.25、0.5、1、2、4、16、32 μg/mL。耐药细胞U251TR培养标准［5］：用MTT法检测U251和U251TR的IC50和耐药指数RF。

用不同浓度的整合素拮抗剂HP0023处理人耐药胶质瘤细胞U251TR并通过MTT法测得胶质瘤细胞的OD值，计算抑制率。取抑制率小于10%的浓度作为HP0023的后续试验浓度。整合素拮抗剂的浓度梯度为：0、0.16、0.32、0.63、1.25、2.5、5、10 μg/mL。

1.3 流式细胞术Annexin V FITC/PI双染法测细胞的凋亡将U251TR分为4组，根据MTT法实验结果，分别采用对照试剂、HYPOO23（0.16 μg/mL）、替莫唑胺（32 μg/mL）和 HYPOO23（0.16 μg/mL）+替莫唑胺（32 μg/mL）处理48 h后。按Annexin V FITC/PI双染法，将细胞用Annexin V⁃FITC、碘化丙啶染色液，然后进行流式细胞仪检测，每组测3个样本。

1.4 Westen blot方法检测MGMT、P⁃gp、MRP和GST蛋白取对数生长期细胞，以1.25×105/mL密度接种于培养瓶中，将耐药细胞U251TR分为4组，24 h后，分别采用对照试剂、拮抗剂、替莫唑胺和拮抗剂联合替莫唑胺处理。48 h后，收集所有细胞，根据Western blot方法检测不同的处理方式对U251TR细胞蛋白表达的影响。

1.5 统计学方法实验数据采用SPSS 19.0软件分析。计量资料用表示，采用单因数方差分析进行组间两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成功培养耐药胶质瘤U251TR细胞本研究使用替莫唑胺溶液浓度递增的方法，经过10个月培养得到耐药细胞U251TR。U251TR/U251的耐药指数RF=8.03±0.46。U251细胞和U251TR细胞的IC50为（4.55± 2.21）μg/mL和（36.54± 5.01）μg/mL，两组间差异有统计学意义（P＜0.05），说明成功构建了耐药细胞U251TR。且以32 μg/mL替莫唑胺作为试验浓度，用不同浓度的HP0023处理人耐药胶质瘤细胞U87TR，通过MTT法测得HP0023浓度为0.16 μg/mL时抑制率为（8.11±2.23）%，以该浓度作为试验浓度。

2.2 流式细胞术Annexin V FITC/PI双染法测细胞的凋亡对照试剂早期凋亡率为（1.8±0.9）%，晚期凋亡率为（3.4±0.8）%；拮抗剂早期凋亡率为（3.8±1.0）%，晚期凋亡率为（3.1±0.9）%；替莫唑胺早期凋亡率为（2.6±1.0）%，晚期凋亡率为（2.2±0.7）%；拮抗剂联合替莫唑胺处理早期凋亡率为（10±1.2）%，晚期凋亡率为（8.5±0.9）%。拮抗剂联合替莫唑胺处理组与其他3组比较，差异有统计学意义（P＜0.05，图1）。

图1 流式细胞术Annexin V FITC/PI双染法测各组U251TR细胞凋亡Fig.1 Flow cytometry Annexin V FITC/PI double staining test groups U251TR cell apoptosis

2.3 Western blot检测耐药蛋白表达水平4个实验组 Western blot检测细胞 MGMT、P⁃gp、MRP 和GST蛋白表达（图2）显示，与对照组和替莫唑胺组相比，HYPOO23组和HYPOO23+替莫唑胺组的MGMT和P⁃gp蛋白表达水平降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。MRP和GST蛋白表达水平未见明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 不同处理方式对MGMT、P⁃gp、MRP和GST蛋白表达水平的影响Fig.2 The impact of MGMT，P⁃gp，MRP and GST protein expression level by different processing methods

3 讨论

研究发现，肿瘤细胞耐药与P⁃糖蛋白（P⁃gly⁃eoprote，P⁃gp）［5-6］、多药耐药相关蛋（multi⁃drug re⁃sistance related protein，MRP）［7］、O6 甲基鸟嘌呤DNA 甲基转移酶（O6⁃methyl⁃guanine⁃DNA ⁃methyl⁃transferase［8］，MGMT）、谷胱甘肽/谷胱甘肽⁃S转移酶（GSH/GSTS）［9］等多种耐药机制有关。然而，近来研究发现，肿瘤细胞的耐药性与整合素密切相关［1-3］。但整合素拮抗剂与耐药胶质瘤细胞的治疗效果相关关系还需深入的研究。

整合素是存在于细胞膜表面，由α亚基和β亚基构成的二聚体，含有细胞外结构域、跨膜α螺旋和细胞内结构域［10-11］。在课题组前期的研究［12-13］中发现，其参与肿瘤的多种恶性生物学行为，如肿瘤细胞的发生、发展、增殖、侵袭及转移等。本研究通过整合素αvβ3拮抗剂HYP0023与替莫唑胺分别或联合处理耐药的神经胶质瘤细胞后，观察神经胶质瘤细胞的凋亡，结果显示经HYP0023联合替莫唑胺处理的耐药胶质瘤细胞的凋亡率比其他3组高；证实阻滞整合素向细胞内传导信号，可提耐药胶质瘤肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，且HYP0023可以提高化疗药的治疗效果。这与HSIEH等［14］阻滞整合素向细胞内传导信号，提高急性淋巴细胞白血病的肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［13］的实验结果相一致。

本研究结果还显示，拮抗剂HYPOO23组和HYPOO23+替莫唑胺组的MGMT和P⁃gp蛋白表达水平降低，而MRP和GST蛋白蛋白表达水平未见明显变化。GAO等［15］发现上调miR⁃370⁃3p影响MGMT表达量，可以提高多形性成胶质细胞瘤的替莫唑胺化疗敏感性。因此，有理由相信，MGMT和P⁃gp蛋白参与整合素拮抗剂提高耐药胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性和促进凋亡的现象。类似的实验结果还未见相关的报道，且具体的作用机制及信号传导途径有待进一步研究。

综上所述，整合素拮抗剂HYP0023可以调节耐药胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性，促进凋亡；并且这现象与MGMT和P⁃gp表达下降有关。但这个现象，还需进一步的动物实验来验证。本课题也为临床克服胶质瘤患者化疗耐药提供了一个新思路。

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