芪茵颗粒对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝组织SREBP-1、SREBP-2的影响

王 洁, 陈俊玲, 杨 旋, 乔治园, 曾斌芳

(1新疆医科大学中医学院， 乌鲁木齐 830011； 2新疆维吾尔自治区人民医院中医科， 乌鲁木齐 830001)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是以遗传环境、胰岛素抵抗、脂代谢紊乱为特征的一种代谢应激性肝损伤，其病理变化与酒精性肝病(ALD)相似，但患者无过量饮酒史,包括非酒精性脂肪性肝炎( NASH)、非酒精性单纯性脂肪肝(NAFL)、NASH相关肝硬化(LC)和肝细胞癌(HCC)[1]。NAFLD有着复杂的发病机制，已严重威胁到人类健康，许多理论仍处于假说阶段，Day[2]提出的二次打击理论是1988年至今最具影响力的理论。本课题前期研究表明[3-4]，芪茵颗粒能明显改善 NAFLD患者肝功能，体质指数(BMI)、血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST);血脂中高密度脂蛋白(HDL-c)、低密度脂蛋白(LDL-c)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)等指标，未发现明显不良反应，然而，目前对其作用机制还不清楚。本研究旨在探讨芪茵颗粒对NAFLD大鼠肝组织中固醇调节元件蛋白1(SREBP-1)、固醇调节元件蛋白2(SREBP-2)表达的影响，进一步探讨其对NAFLD的治疗作用机理。

1 材料与方法

1.1实验动物雄性SD大鼠72只，体质量(200±20)g，大鼠(SPF级)由新疆医科大学第一附属医院科技楼实验动物中心提供[实验动物许可编号：SCXK(新)2014-0011]。

1.2试剂与仪器硫普罗宁片(批号：P20150307-2)，河南省新宜药业有限公司；SREBP-1酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(批号：DRE21279)，武汉基因美生物科技有限公司；SREBP-2酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(批号：DRE21283)，武汉基因美生物科技有限公司；石蜡切片机(型号：LEICA RM2135)；三目显微镜(型号：DM3000B)；台式离心机(型号：TD5AWS)。

1.3实验药物“芪茵颗粒”免煎剂(由生黄芪、茵陈、生山楂、泽泻、生大黄、三七粉、补骨脂、决明子、苦丁茶等组成)，购于新疆医科大学附属中医医院(江苏天江药业提供),用温水混合芪茵颗粒，煎煮5 min，生药浓度1 g/mL。

1.4动物模型的制备及分组给药方法将雄性SD大鼠72只，按随机数字表法随机分为模型组、空白对照组、芪茵颗粒低、中、高剂量组和阳性药物硫普罗宁(商品名：凯西莱)组，进行适应性喂养1 w，每组各12只，除空白对照组予常规饲养外，剩余 5组灌胃高脂乳剂(30 g猪油，10 mL吐温，10 g胆固醇，10 mL丙二醇、3 g猪胆酸加蒸馏水至100 mL)，每日1次，每次10 mL/kg体质量，持续灌胃10 w，建立NAFLD模型，第10周末随机在各组间抽取大鼠2只，用12只大鼠肝组织制作肝脏病理切片，观察肝脏组织病理学变化，确定造模成功。从第10周起，各组大鼠饮食恢复正常，空白对照组和模型组予10 mL/kg体质量蒸馏水灌胃，芪茵颗粒低、中、高剂量组分别以2.5、5、10 mL/kg体质量灌胃治疗，硫普罗宁组给药剂量为20 mg/kg体质量灌胃，时间为10 w。

1.5取材与处理末次给药后12 h，大鼠禁食不禁水，测体质量并记录，10%的水合氯醛(3 mL/kg体质量)腹腔注射麻醉，大鼠开腹，分离出完整肝脏后称重并记录，取肝左叶相同部位的肝组织，匀浆机匀浆，取上清液-20℃保存待用；取肝右叶边缘约1 cm×1 cm×0.5 cm 组织，4%多聚甲醛24 h过夜固定，不同浓度酒精脱水，浸蜡、包埋，切片、烤片，伊红苏木精染色，封片，光镜下观察肝组织形态。

1.6指标的检测动物体质量及肝指数：肝指数=肝湿重/体质量×100%；肝组织病理学：取肝脏组织石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察；组织匀浆用ELISA法测定SREBP-1、SREBP-2的含量。

2 结果

2.1各组大鼠体质量和肝指数的变化芪茵颗粒低、中、高剂量组治疗前、后大鼠体质量增长的速度明显低于模型组大鼠治疗前、后体质量的增长(P<0.05)。与模型组相比，芪茵颗粒中、高剂量组治疗后的体质量明显减少(P<0.05)，芪茵颗粒低剂量组体质量与空白对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，与芪茵颗粒低剂量组相比，芪茵颗粒中、高剂量组体质量减少更为显著(P<0.05)。与空白对照组相比，模型组肝指数明显增高(P<0.05)。治疗后芪茵颗粒高、中、低剂量组肝指数与模型组相比均降低(P<0.05)，见表1。

表1 芪茵颗粒对NAFLD大鼠体质量和肝指数的影响

注：与模型组比较,aP<0.05； 与空白对照组比较,bP<0.05； 与芪茵颗粒低剂量组比较，cP<0.05。

2.2芪茵颗粒对NAFLD大鼠肝组织病理学变化的影响空白对照组大鼠组织可见结构清楚的肝小叶，并伴有完整排列的肝索，无脂肪变。模型组大鼠可见排列杂乱的肝索，并伴随明显的肝细胞体积变大、水肿等存在于不同大小的胞浆内，可见脂肪空泡，细胞核受压移位，炎症细胞浸润的肝小叶，以及中度及重度肝细胞脂肪变性，其肝脏NAS积分与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，芪茵颗粒高、中、低剂量组及硫普罗宁组均能不同程度的降低肝脏NAS积分，减轻肝细胞脂肪变性、炎症浸润和细胞水肿。与硫普罗宁组相比，芪茵颗粒中、高剂量组能显著降低肝脏NAS积分(P<0.05)。与芪茵颗粒低剂量组比较，芪茵颗粒中剂量组和高剂量组均能显著降低肝脏NAS积分(P<0.05)。芪茵颗粒中剂量组和高剂量组内炎性渗出与水肿明显减少，偶见少量脂肪滴散在分布，可见清晰整齐的肝小叶及肝索,结果见图1和表2。

A：空白对照组

B：模型组

C：硫普罗宁组

D：芪茵颗粒高剂量组

E：芪茵颗粒中剂量组

F：芪茵颗粒低剂量组

图1 NAFLD大鼠肝组织HE染色病理切片(×200) 表2 肝脏NAS活动度积分

注：与空白对照组比较，aP<0.05； 与模型组比较,bP<0.05； 与硫普罗宁组比较,cP<0.05; 与芪茵颗粒低剂量组比较,dP<0.05。

2.3芪茵颗粒对肝组织匀浆中SREBP-1、SREBP-2含量的影响与空白对照组比较，模型组、芪茵颗粒高、中、低剂量组及硫普罗宁组SREBP-1、SREBP-2含量均显著升高(P<0.05)；与模型组比较，芪茵颗粒高、中、低剂量组及硫普罗宁组SREBP-1、SREBP-2含量均明显降低(P<0.05)；与硫普罗宁组比较，芪茵颗粒高、中剂量组SREBP-1、SREBP-2含量明显降低(P<0.05)，见表3。

表3各组大鼠肝组织SREBP-1、SREBP-2含量比较

组别只数SREBP-1SREBP-2空白组924.92±2.2212.52±0.62模型组965.51±2.12a42.08±1.53a硫普罗宁组1044.75±1.68ab24.18±1.37ab芪茵颗粒低剂量组951.67±1.75ab30.35±1.34ab芪茵颗粒中剂量组1039.38±1.85abc22.30±0.99abc芪茵颗粒高剂量组932.88±1.85abc19.31±1.39abc

注：与空白对照组比较，aP<0.05； 与模型组比较,bP<0.05； 与硫普罗宁组比较,cP<0.05。

3 讨论

随着经济的高速发展，新疆地区人民物质生活水平得到了极大提高，NAFLD发病率逐年上升,并影响着人们的健康。2010年4-6月，对来自克拉玛依市健康体检中心的2 858例健康人群和天河社区全体居民进行了NAFLD患者分析，结果表明[5]：NAFLD患病人数为1 043例，总患病率为36.49%。非酒精性脂肪肝的发病机制复杂多变，脾肾亏虚，瘀浊内阻肝络是诸多学者较为认同的观点。芪茵颗粒是新疆医科大学附属中医医院院内协定处方，根据非酒精性脂肪肝“肝脾肾同调，痰瘀滞同治” 的创新理论组方，针对脾肾两虚，痰瘀互结的病机关键，以虚湿瘀滞并治，肝脾肾同调为主要治则。“芪茵颗粒”方中以生黄芪、茵陈二者为君，补脾胃同时亦可清肝之湿热；以三七粉、决明子二者为臣，祛瘀化浊，清热解郁；生大黄、生山楂、泽泻、补骨脂四药共佐，祛瘀活血、滋补肝肾；苦丁茶为使，化痰清热、化积消脂。组方精良，有良好的调理肝、脾、肾功能，有助于消化、祛湿、活血作用。

甾固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)在动物蛋白合成脂肪的过程中起到极为重要的作用，通过调节脂肪细胞分化及相关酶(生于脂肪酶)的转化来调节这些酶的活性，从而控制脂肪合成基因的转移[6]；SREBP-1a、SREBP-1c、SREBP-2 是参与调节脂肪酸代谢的重要蛋白，其中SREBP更是肝脏脂肪酸代谢的重要途径的关键因子，是属于动物脂肪酶脂合酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、苹果酸酶、L-丙酮酸激酶和S14蛋白的一部分[7]。正常情况下，大鼠肝脏SREBPs蛋白表达较低，当受到高脂饮食的诱导下，其表达明显增高，并与NAFLD的严重程度密切相关，表明SREBPs表达的增强，可以导致脂肪酸代谢失衡，TG合成增多，从而导致非酒精性脂肪肝的发生[8]。本研究结果显示芪茵颗粒能抑制NAFLD大鼠体质量增长过快，并且能不同程度降低大鼠肝组织脂肪变性，并且与硫普罗宁组比较，芪茵颗粒高剂量组和中剂量组均能明显降低NAFLD大鼠肝组织中SREBP-1、SREBP-2的含量，表明芪茵颗粒能够降低NAFLD大鼠肝组织中SREBP-1、SREBP-2的含量，并且可显著改善肝组织脂肪变性，从而纠正脂肪酸代谢失衡，阻止NAFLD的发生。

综上所述，芪茵颗粒可以控制NAFLD大鼠体质量增长，显著改善NAFLD大鼠肝指数和肝组织脂肪变性，降低NAFLD大鼠肝组织中SREBP-1、SREBP-2的含量，调节与脂肪生成相关酶(生脂酶)的基因转求而调节这些酶的活性，减少肝组织脂质沉积，从而发挥治疗NAFLD的作用。

参考文献：

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[3] 张金颖，曾斌芳.芪茵颗粒治疗酒精性脂肪肝的临床疗效分析[J].新疆中医药杂志，2008，26(2)：19-20.

[4] 赵智宏，王转国，陈俊玲，等.芪茵茶治疗非酒精性脂肪肝(肝郁脾虚型)56例临床观察[J].云南中医中药杂志，2010，31(5)：21-22.

[5] 崔喜闻.新疆克拉玛依市居民非酒精性脂肪肝流行病学调查[D].乌鲁木齐：新疆医科大学，2012.

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[7] YU-POTH S, YIN D, KRIS-ETHERTON P M, et al. Long-chain poly-unsaturated fatty acids upregulate LDL receptor protein expression in fibroblasts and HepG2 Cells[J]. J Nutr， 2005,135(11)：2541-2545.

[8] 艾正琳,陈东风.SREBP-1c在大鼠非酒精性脂肪性肝病中的表达及意义[J].第三军医大学学报,2006,28(10)：1063-1065.