山西省奶牛乳腺炎流行病学调查研究

武守艳,董春光,韩文儒,杨丽华,刘文俊,陈剑波,韩一超

(山西省农业科学院畜牧兽医研究所,山西 太原 030032)

近年来,奶业已成为我国快速发展的新兴产业,随着奶牛业的飞速发展,饲养数量和饲养规模急剧加大,奶牛疾病的防治也给奶牛业带来了巨大的压力,且疾病的种类和病原呈现出多样性的变化。奶牛乳腺炎是奶牛常见和多发病之一,一直以来是困扰奶牛业的一大难题,它不仅造成乳品营养成分降低、质量下降、而且影响食品卫生,危害人体健康[1]。尽管在国内外一直是人们研究的热点、难点,但仍然给奶牛业造成了很大的经济损失。据文献报道,奶牛乳腺炎主要由多种非特定病原微生物引起,不同地区不同季节奶牛乳腺炎致病菌的分布和种类均有差异[2]。本研究在2015-2016年通过对山西省榆次、清徐、祁县、太谷、山阴、永济及太原郊区奶牛场1 300头奶牛进行乳腺炎流行病学调查,采集奶样进行病原的分离、培养、鉴定及药敏试验研究,为当地奶牛乳腺炎的综合防治提供理论基础和有效的临床指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基 沙保劳琼脂、鲜血琼脂、麦康凯琼脂、S.S.、琼脂、普通琼脂、营养肉汤、科玛加培养基,均购自遐迩商贸有限公司。

1.1.2 药品与试剂 药敏纸片:头孢西丁、头孢克洛、阿米卡星、环丙沙星、诺氟沙星、头孢曲松、头孢哌酮、阿莫西林、氨曲南、亚胺培南、头孢唑啉、利奈唑胺。5氟胞嘧啶 、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素,均购自遐迩商贸有限公司;CMT试剂,购自太原天和试剂有限公司。

1.1.3 仪器 法国梅里埃VITEK-2全自动微生物鉴定药敏仪。

1.1.4 试验动物 选择20只ICR小鼠,级别为清洁级,许可证号为scxk(晋)2015—0001为试验动物,购自山西医科大学实验动物室。

1.2 方法

1.2.1 奶样采集 奶样采集于山西省榆次、清徐、祁县、太谷、山阴、永济及太原郊区奶牛场,共采集样品120份,其中采自确诊为临床型乳腺炎奶牛的患病乳区的奶样65份,用CMT试剂检测为隐性乳腺炎的奶样55份。采样时先用温水洗净乳头,再用0.1%新洁尔灭清洗整个乳房,最后用75%酒精擦拭乳头,待酒精干后弃去前三把乳汁,然后在每个乳区无菌挤出奶样约10 mL放入灭菌试管中,标明牛号、乳室、日期,冰盒保存立即送回实验室检测(不超过4 h)。

1.2.2 病原的分离培养 将样品摇匀后,取5 mL置于灭菌离心管中以3 000 r/min离心10 min,弃去离心管中的上层液体,留取底部沉淀物,无菌操作吸取沉淀物0.1 mL,分别接种于鲜血琼脂、麦康凯琼脂、S.S.、琼脂,普通营养琼脂,营养肉汤中,37 ℃恒温箱内培养24 h,观察培养基上菌落生长情况和特征,挑取菌落进行涂片,革兰染色,镜检,根据菌落特征,溶血情况。染色特性及菌体形态,初步判定细菌类属,并将其进一步纯化培养。同时将营养肉汤过夜增菌后,接种于沙堡劳琼脂培养基,普通琼脂培养基和科玛加培养基,37℃培养48 h后,进行菌落形态观察,并用革兰染色液染色镜检细菌形态、大小。

1.2.3 病原菌鉴定 按仪器操作说明书使用VITEK-2全自动微生物鉴定药敏仪,进行生化分析,从而鉴定菌种。

1.2.4 药敏试验 取1.1.2备好的药敏纸片,选取典型的分离菌株,按照纸片扩散法和MIC(最小抑菌浓度)法对分离的菌株进行药物敏感性试验,参考世界临床实验室标准委员会(NCCLS)推荐的纸片扩散标准和MIC(最小抑菌浓度)标准分别对细菌和真菌药敏试验判定结果。

1.2.5 致病性试验 用无菌注射器抽取典型细菌经18 h的肉汤培养液,腹腔接种小鼠0.5 mL/只,每种菌接种4只,同时,设无菌生理盐水空白对照,观察72 h并记录细菌对小鼠的致病性,将死亡小鼠的肝、脾、肾等脏器进行细菌分离鉴定。

2 结果

2.1 病原菌的分离培养,鉴定结果 见表1。从表1可以看出,120份样品共分离出8种402株病原菌,经鉴定其中大肠杆菌78株(19.4%)、大肠杆菌ESBL阳性株18株(4.5%)、葡萄球菌88株(21.9%)、链球菌95株(23.6%)、粪肠球菌15株(3.7%)、藤黄微球菌25株(6.2)、洛菲不动杆菌株16(4.0%)、小型原藻40株(10.0%)、克柔念珠菌45株(11.2%)。

2.2 药敏试验结果 见表2、3和4。

表1 病原菌分离鉴定结果

表2 纸片扩散法细菌药敏试验判断标准 (mm)

表3 真菌最小抑菌(MIC)浓度法药敏试验判定标准(mg/L)

从表4可以看出,大肠杆菌除对阿莫西林中介(中度敏感)外,对其他药物均敏感;大肠杆菌ESBL+(耐β内酰胺酶)对头孢类、阿莫西林、氨曲南均耐药,对亚胺培南、利奈唑胺敏感;链球菌除对头孢唑啉耐药,对阿莫西林、利奈唑胺、环丙沙星、阿米卡星中介(中度敏感)外,对其他药物均敏感;葡萄球菌对阿莫西林、头孢唑啉中介(中度敏感),对其他药物均敏感。

表4 主要致病菌药敏试验结果 (mm)

表5 真菌MIC(最低抑菌浓度)法药敏试验结果(mg/L)

从表5可以看出,小型原藻对5氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑均耐药,对两性霉素敏感;克柔念珠菌对5氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑均耐药,对伏立康唑、两性霉素敏感。

2.3 致病性试验结果 将各种细菌及真菌菌液注射小鼠腹腔后,将死亡小鼠脏器进行病原菌的分离培养及鉴定,结果与接种菌完全相同。

3 讨论

3.1 本试验中共采集样品120份,分离出8种402株病原菌,经鉴定其中大肠杆菌78株(19.4%)大肠杆菌ESBL阳性株18株(4.5%),葡萄球菌88株(21.9%)、链球菌95株(23.6%)、粪肠球菌15株(3.7%)、藤黄微球菌25株(6.2)、洛菲不动杆菌16株(4.0%)、小型原藻40株(10.0%)、克柔念珠菌45株(11.2%)。从试验结果可以看出,主要病原菌为大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、小型原藻和克柔念珠菌。

3.2 药敏试验结果表明,大肠杆菌除对阿莫西林中介(中度敏感)外,对其他药物均敏感;大肠杆菌ESBL阳性株(耐β内酰胺酶)对头孢类、阿莫西林、氨曲南均耐药,对亚胺培南、利奈唑胺敏感;链球菌除对头孢唑啉耐药,对阿莫西林、利奈唑胺、环丙沙星、阿米卡星中介(中度敏感)外,对其他药物均敏感;葡萄球菌对阿莫西林、头孢唑啉中介(中度敏感),对其他药物均敏感。小型原藻对两性霉素敏感,克柔念珠菌对伏立康唑、两性霉素均敏感。细菌对某种药物耐药性的出现与平时该药的使用频率高有关,为了预防长期用一种药物治疗引起的病原菌的耐药性,最好定期进行药敏试验。

3.3 据资料报道奶牛乳腺炎的致病菌是多种非特定病原微生物,而且奶牛乳腺炎的发生与环境、季节、营养、遗传等多种因素有关,但是多年以来,山西省奶牛乳腺炎的病原菌主要是大肠杆菌、链球菌和葡萄球菌[3],2015-2016年通过对山西省奶牛乳腺炎流行病学调查研究,发现近年来本省本病的病原有所变化,除常见细菌外,还增加了真菌的感染,同时ESBL阳性大肠杆菌(耐β内酰胺酶)感染病例增加,这样的结果在同类的研究中报道较少。

3.4 β内酰胺酶能分解青霉素类、头孢菌素类等β内酰胺类抗生素,使这些类抗生素对细菌无效或使细菌对这些药物耐药。ESBL阳性大肠杆菌致病菌病例的增加给奶牛乳腺炎的治疗造成很大的困难,据人医方面的文献报道,20世纪90年代产β内酰胺酶肠杆菌愈演愈烈,而β内酰胺酶也由普通酶进展至广谱酶(ESBL),青霉素类、头孢菌素第1代的过度使用导致产ESBL菌株出现[4],笔者认为动物方面的情况与人医方面相同,近年来,养殖业中抗生素的大量滥用也是造成ESBL阳性大肠杆菌(耐β内酰胺酶)病例增加的主要原因,因此,为了减少细菌耐药,养殖业中应限制青霉素类、头孢菌素的滥用。

3.5 近年来山西省奶牛乳腺炎的病原从单一的细菌感染发展为真菌和ESBL阳性大肠杆菌感染,这一现象的出现笔者认为与当前奶牛养殖业中抗生素的大量滥用有密切的关系,一方面抗生素的大量滥用造成了动物机体内的菌群失调,导致二重感染,这是真菌感染的一种可能,另一方面ESBL阳性大肠杆菌病例的增加与青霉素和头孢菌素的过度使用有着密切关系。ESBL阳性大肠杆菌病例的出现增加了治疗的难度和成本。碳青霉烯环的抗生素对ESBL阳性大肠杆菌感染病例有效,药敏试验中的亚胺培南为碳青霉烯环的抗生素,效果良好,但药物成本较高,增加了该病的治疗成本,加大了对养牛业的危害,更加降低了养牛业的经济效益。通过这次调研,提示我们在临床治疗奶牛乳腺炎时,应该充分考虑到病原的多样性,尤其真菌性乳腺炎,盲目使用抗生素治疗,导致真菌性乳腺炎逐步恶化,且久治不愈,给奶牛场带来较大的经济损失。尽量做到早发现,早诊断,早治疗,以减少经济损失[5]。

3.6 本研究中的病原菌粪肠球菌、藤黄微球菌、洛菲不动杆菌均属条件性致病菌,奶牛养殖场的饲养管理不够完善,奶牛机体抵抗力低下这些条件性致病菌就会引起发病。

参考文献:

[1] 王春璈.奶牛场兽医师手册[M].北京:金盾出版社,2008.

[2] 齐长明,奶牛疾病学[M].北京:中国农业科学技术出版社,2006:432.

[3] 武守艳,韩一超,陈剑波,等.山西省奶牛乳腺炎病原菌调查研究[J].中国奶牛,2013,35(16):28-30.

[4] 王小兰,林立中,夏先考,等.ESBL阳性大肠埃希菌AmpC酶的检测及其耐药分析[J].医学临床研究,2006,23(12):1 930-1 934.

[5] 孙英峰,王秀珍,李秀丽,等.奶牛真菌性乳房炎病原菌的分离鉴定及其致病性研究[J].中国奶牛,2009,31(6):33-35.