氨基多糖纳米微粒对RAW264.7细胞分泌 TNF-α、IL-1β影响的试验

赵义龙,黄金凤,赵金香,矫继峰

(1.新疆农业职业技术学院,新疆 昌吉 831100;2.昌吉市华牧动物诊所,新疆 昌吉 831100;3.营口理工学院 ,辽宁 营口 115014)

氨基多糖(GAG)广泛存在于动物体内,在自然界中产量非常丰富。GAG具有辅助免疫、抗菌、抗病毒等生物学活性。纳米材料是颗粒直径在1～100 nm范围内且具有表面效应、小尺寸效应及量子尺寸效应等特殊效应的一类材料。氨基多糖纳米微粒(Chitosan nanoparticle,CNP),是氨基多糖结合纳米科技研制的新型多糖纳米粒子。该纳米微粒据推测除应具有辅助免疫、抗菌等特性外应兼具纳

巨噬细胞是免疫效应细胞,具有多种免疫功能,包括免疫防御、免疫监视、免疫调节等,在机体的先天性免疫系统中发挥重要作用[1-2]。TNF-α、IL-1β是活化的巨噬细胞杀灭病原微生物、提高机体免疫力的主要细胞分子[3-4],因此本试验选择鼠源巨噬细胞株RAW264.7来探讨CNP对分泌细胞因子TNF-α、IL-1β的影响,揭示CNP促进免疫功能的作用机理,为氨基多糖在动物微生态制剂开发及综合利用方面提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 氨基多糖纳米微粒为浙江大学饲料科学研究所动物分子营养教育部重点实验室制备。TNF-α ELISA检测试剂盒,购自武汉博士德生物技术有限公司;IL-1βELISA检测试剂盒,购自武汉博士德生物技术有限公司;DMEM高糖培养液、胎牛血清、PBS、Hank′s,购自杭州四季青生物工程材料有限公司;胰酶、DMSO,购自美国Sigma公司;RAW264.7细胞,购自中国科学院上海生化细胞所干细胞库。

1.2 试验仪器 纳米粒度及Zeta电位分析仪(Zetasizer Nano-ZS90,Malvern Instruments);超净工作台(HERA),购自HermLe公司;CO2培养箱,购自SANYO公司;倒置显微镜,购自Olympus公司;多功能酶标仪(MRX),购自美国Dynex技术公司。

1.3 试验分组 将鼠源巨噬细胞RAW 264.7复苏后,按常规细胞培养方法培养,待细胞对数生长期时用于实验,用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液调整细胞浓度至1×107个/mL,将每块6孔板的3孔作为试验组、3孔作为对照组,做3次重复试验。每孔加入细胞悬液2 mL,置于5%CO2,37℃培养箱中孵育6 h,倾去培养液后,每孔加入2 mL含10%胎牛血清的无酚红DMEM高糖培养液,试验组加入CNP(终浓度为0.3 mg/mL)0.2 mL,对照组则为DMEM完全培养液。因前期在裸鼠试验中采用终浓度为0.1 mg/mL、0.3 mg/mL、0.5 mg/mL、0.7 mg/mL进行用药测试,结果终浓度为0.3 mg/mL的用药效果最好,故本试验选取其作为最佳终浓度。将细胞置于5%CO2、37℃培养12 h、18 h及24 h后收集细胞上清液,运用酶联免疫法测定CNP对细胞因子TNF-ɑ、IL-1β 的影响[5-6]。

1.4 数据分析 用统计软件SPSS 19.0进行统计分析。试验数据以表示。组间数据比较采用单因素方差分析,P<0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 各时间段CNP对TNF-ɑ的影响 通过试验发现,CNP试验组(CNP剂量为0.2 mL)不同时间段对巨噬细胞RAW264.7作用后其差异均存在统计学意义,具体如表1。

表1 各时间段CNP作用RAW264.7产生TNF-α的影响

由表1可知氨基多糖纳米微粒(CNP)12 h加药组与除24 h对照组外的各组均除差异显著;18 h加药组与其他各组均差异显著;24 h加药组与其他各组均差异显著。因此说明CNP对巨噬细胞分泌TNF-ɑ具有明显的促进作用。

2.2 各时间段CNP对IL-1β的影响 通过试验发现,CNP试验组(CNP剂量为0.2 mL)不同时间段对巨噬细胞RAW264.7作用后其差异均存在统计学意义,具体如表2。

表2 各时间段CNP作用RAW264.7产生IL-1β的影响

从表2可知,氨基多糖纳米微粒(CNP)12 h加药组与除18 h加药组外其他各组均差异显著;18 h加药组与除12 h加药组外其他各组均差异显著;24 h加药组与其他各组均差异显著,因此说明CNP对巨噬细胞分泌IL-1β具有一定的促进作用。

3 讨论

3.1 氨基多糖被认为是迄今为止自然界惟一的一种带阳离子的天然多糖,在自然界中广泛存在[7-9]。CNP是经纳米处理的带有氨基的高分子材料,通过本实验可以证明CNP能促进巨噬细胞分泌TNF-α、IL-1β等细胞因子,对机体免疫系统有激活和促进作用,其具有辅助免疫的特性。

3.2 RAW264.7巨噬细胞株是BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞经过白血病病毒诱生后产生的具有无限繁殖能力的细胞系,具有与腹腔细胞相同的功能和特点,可以替代腹腔巨噬细胞并且避免了原代细胞不能无限繁殖的缺点[10-12]。本试验选取RAW264.7为巨噬细胞模型,即模拟体内环境,又避免了原代细胞的缺陷,为本实验的顺利进行提供基础条件。

3.3 CNP可能通过多条信号转导途径调节免疫细胞的功能和代谢,此为氨基多糖发挥免疫调节作用的重要机制,其中氨基多糖激活巨噬细胞从而调节免疫功能是较为重要的途径[13]。CNP可以识别并结合巨噬细胞表面多种模式识别受体,经各种信号传导通路将信号传入细胞内,引起细胞内一系列的信号级联反应,从而调控相关基因表达,分泌多种免疫活性物质而发挥免疫调节作用[14]。

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