桑葚中克百威和3-羟基克百威残留量测定

李国烈，蒋金芳，苏 旭，覃明丽，杜 鑫，何沛蓉，何家国



桑葚中克百威和3-羟基克百威残留量测定

李国烈，蒋金芳，苏 旭，覃明丽，杜 鑫，何沛蓉，何家国

(南充农产品质量监测检验中心，四川南充 637000)

建立了桑葚中克百威和3-羟基克百威残留检测的超高效液相色谱-串联质谱方法(ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)。桑葚样品经乙腈提取，石墨化碳黑氨基复合柱(Carbon/NH2)净化，以甲醇和0.1%甲酸水溶液作为流动相洗脱，采用电喷雾离子源正离子模式(ESI+)，多反应监测(MRM)方式进行采集，外标法定量。结果表明，克百威和3-羟基克百威在1.00~200.00 µg/L浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数(R)均大于0.99，方法检出限均为0.25 µg/kg，定量限均为1.00 µg/kg。在1.00~100.00 µg/kg添加浓度范围内，回收率、精密度和基质效应均满足分析方法要求。该试验方法适用于桑葚中克百威和3-羟基克百威残留量的测定。

桑葚；克百威；3-羟基克百威；残留；基质效应；超高效液相色谱-串联质谱

克百威(carbofuran)和3-羟基克百威(3-hydroxycarbofuran)属于广谱、高效的氨基甲酸酯类杀虫、杀螨、杀线虫剂，具有内吸、触杀、胃毒作用，并有一定的杀卵作用，曾广泛用于害虫的防治，如蚜虫、害螨等[1-4]。但是，由于克百威和3-羟基克百威具有高毒性，现已经被美国及我国明令禁止用于部分农产品，农业部199号公告禁止克百威在蔬菜、果树、茶叶和中草药材上使用[5-7]。然而，由于克百威和3-羟基克百威具有良好的防治效果，在生产中还存在违规使用的现象，在蔬菜、水果上时有检出[8]。GB 2763-2016《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中规定，其残留物为克百威和3-羟基克百威之和，以克百威表示，在水果中的最大残留限量为0.02 mg/kg[9]。

目前，克百威和3-羟基克百威在蔬菜和水果中的残留检测报道比较多，检测基质包括了辣椒、黄瓜、豇豆、番茄、苹果、葡萄、草莓、蜂蜜、小麦、水稻和土壤等[1,4-7,10-15]，但尚未见这2种农药在桑葚基质中的残留检测报道。本试验建立了桑葚中克百威和3-羟基克百威残留检测的超高效液相色谱-串联质谱方法(UPLC-MS/MS)，以期为桑葚中克百威和3-羟基克百威的残留检测提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验药品和试剂

克百威(标准品编号为GBW(E)081312)和3-羟基克百威(标准品编号为GBW(E)081313)标准品购于农业部环境质量监督检验测试中心(天津)，甲醇、乙腈、甲苯、甲酸均为质谱级，购自Fisher公司。

1.2 仪器和设备

超高效液相色谱-质谱仪(Waters，UPLC-TQS)，色谱柱(Waters，Xbridge C18，3.5 µm 3.0×50 mm)，固相萃取装置(Agilent)，50 mL离心管(Eppendorf)，固相萃取小柱(Agilent，Mega BE CARB/NH2500 mg/6 mL)，摇床(IKA，HS501)，氮吹仪(Organomation，N-EVAP112)，旋涡混合器(IKA，Vortex Genius 3)，离心机(Sigma，3-18KS)，超纯水仪(Millipore，Milli-Q)以及微孔滤膜(津腾，PTFE 0.22 µm)等。

1.3 样品前处理

准确称取匀浆后的桑葚样品10.00 g于50 mL离心管中，加入20.00 mL乙腈，置于摇床上振摇30 min，加入5 g氯化钠，盖上塞子，剧烈震荡1 min，置于离心机中10 000 r/min离心10 min，移取上清液10.00 mL待净化。

1.4 样品净化

将移取的10.00 mL提取液加入已经过5 mL乙腈＋甲苯(体积比为3︰1)预淋洗Mega BE CARB/NH2柱，收集淋洗液，再用25 mL乙腈＋甲苯(体积比为3︰1)分5次洗脱，合并淋洗液，于40 ℃氮吹吹至近干，用5.00 mL 50%甲醇定容，旋涡混合器混匀后过0.22 µm滤膜，待检测。

1.5 超高效液相色谱-质谱条件

流动相采用甲醇、乙腈和含有0.1%甲酸水溶液进行梯度洗脱，洗脱程序见表1，流动相使用前用超声波脱气。色谱柱温：35 ℃，样品室温度16 ℃，进样量：1 µL。质谱采用电喷雾离子源正离子模式(ESI+)，多反应监测(MRM)方式进行采集。脱溶剂气和锥孔气均为高纯氮气，流量分别为1 000 L/h和150 L/h，碰撞气为高纯氩气，流量为0.10 mL/min，脱溶剂温度为500 ℃。定量离子对、定性离子对、毛细管电压、锥孔电压和碰撞电压等相关参数见表2。

表1 流动相及梯度洗脱条件

表2 测定桑葚中克百威和3-羟基克百威残留的质谱参数

1.6 方法标准曲线和检测限

用桑葚空白基质溶液配制浓度为1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00 µg/L的克百威和3-羟基克百威基质标准溶液，采用1.5仪器条件进行分析，分别以克百威和3-羟基克百威定量离子的峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标作标准曲线，并进行回归分析求出回归方程和相关系数。标准曲线采用Masslynx V4.1软件绘制。检出限采用在最低浓度附近添加一系列已知浓度的双份样品进行测定，采用Masslynx V4.1软件计算克百威和3-羟基克百威的信噪比(S/N)，以S/N≥3时的样品浓度为方法检出限[16]。

1.7 方法回收率和精密度

回收率试验采用加标回收试验法。取桑葚空白样品，按照添加浓度1.00、10.00、100.00 µg/kg3分别加入相应的克百威和3-羟基克百威标品溶液中，每个浓度水平做6个平行。所有样品按1.3和1.4进行样品前处理，采用1.5仪器条件测定药物浓度，根据随行测定的基质标准曲线计算样品的实测浓度。回收率(%)=样品实测浓度/样品理论浓度×100%。精密度试验采用加入法，参照回收率试验方法，所有样品连续测定3 d，根据随行测定的基质标准曲线计算样品的实测浓度，采用Microsoft Excel 2010软件计算该方法的日内和日间精密度。

1.8 方法基质效应

采用Matuszew ski等[17]提出的方法，比较不同条件下的峰面积平均值。在纯的克百威和3-羟基克百威标品溶液(A)，桑葚样品基质提取后添加克百威和3-羟基克百威标品(B) 2个条件下，分别采用1.00、10.00、100.00 µg/L 3个质量浓度来评价克百威和3-羟基克百威在桑葚样品中的基质效应，每个条件下重复测定5个样品，基质效应为B/A。

2 结果与分析

2.1 方法选择性

该试验条件下，克百威和3-羟基克百威采用反相液相色谱分离，流动相中加入0.1%体积分数的甲酸来提高ESI+的离子化效率。结果表明，克百威和3-羟基克百威保留时间分别为4.61 min和3.84 min，峰形及分离度良好，且可获得较强的分子离子峰强度，桑葚基质对桑葚样品中克百威和3-羟基克百威的测定干扰小。克百威基质标准溶液图谱、克百威桑葚空白样品图谱和克百威桑葚加标样的图谱分别见图1、图2和图3；3-羟基克百威基质标准溶液图谱，3-羟基克百威桑葚空白样品图谱和3-羟基克百威桑葚加标样的图谱分别见图4、图5和图6。

2.2 标准曲线和检测限

克百威和3-羟基克百威基质匹配标准曲线在质量浓度1.00~200.00 µg/L时线性关系良好，标准曲线回归方程分别为=3.385 25×107+927.5(2=0.999，权重为1/)和=4.841 57×106+190.8(2=0.999，权重为1/)。以3倍基线噪音的药物浓度为最低检出限，克百威和3-羟基克百威在桑葚中的方法检出限均为0.25 µg/kg。以4倍方法检出限为定量限，则克百威和3-羟基克百威在桑葚中的定量限为1.00 µg/kg[16]。

图1 克百威基质标准溶液图谱(5.00 µg/L)

图2 克百威桑葚空白样品图谱

图3 克百威桑葚加标样图谱(5.00 µg/kg)

图4 3-羟基克百威基质标准溶液图谱(5.00 µg/L)

图5 3-羟基克百威桑葚空白样品图谱

图6 3-羟基克百威桑葚加标样图谱(5.00 µg/kg)

2.3 方法回收率和精密度

该试验条件下，克百威和3-羟基克百威在桑葚中3个添加浓度下的回收率分别为106.72%、96.01%、89.68%和100.62%、95.65%、87.45%，相对标准偏差均在5.00%以内(表3)，表明该试验方法在测定桑葚中克百威和3-羟基克百威的残留时具有较好的回收率。方法的日内精密度相对标准偏差分别为4.22%、2.07%、2.25%和2.19%、2.80%、1.59%，日间精密度相对标准偏差分别为4.00%、3.57%、3.74%和3.64%、4.52%、2.57%(表4)，表明该试验方法在检测桑葚中的克百威和3-羟基克百威时，具有很好的重现性和稳定性。

2.4 方法基质效应

在该试验条件下，采用Matuszew ski等[17]提出的方法从3个质量浓度水平来评价克百威和3-羟基克百威在桑葚样品中的基质效应，其结果见表3。在1.00、10.00、100.00 µg/L 3个质量浓度水平下，克百威在桑葚样品中的基质效应分别为(91.92±4.04)%、(91.07±0.78)%和(90.61±1.32)%，3-羟基克百威在桑葚样品中的基质效应分别为(94.30±5.14)%、(91.30±1.10)%和(91.73±1.11)%。从结果可知，2种农药在桑葚样品中的基质效应均表现为基质抑制效应，并都随着药物添加质量浓度的增加而增强，但基质效应平均值为90.61%~94.30%，说明基质效应对测定结果的影响较小。

表3 桑葚中克百威和3-羟基克百威的回收率(n=6)

表4 桑葚中克百威和3-羟基克百威的日内精密度和日间精密度(n=6)

表5 3个不同质量浓度下的信号峰面积及基质效应(n=5)

3 结 论

该试验中桑葚样品采用乙腈提取，石墨化碳黑氨基复合柱净化，超高效液相色谱－串联质谱(UPLC-MS/MS)测定其中克百威和3-羟基克百威的残留量。此法前处理过程操作简便，方法的选择性、检测限、回收率、精密度、基质效应和标准曲线线性范围及其相关系数均满足样品分析方法要求，适用于桑葚中克百威和3-羟基克百威的残留检测。

[1] 王素琴, 王旭, 沈莹华. 液相色谱-串联质谱法测定蔬菜水果中克百威残留量[J]. 农药科学与管理, 2017, 38(3): 45－48.

[2] 陈建波, 王云飞, 奚道珍. 克百威及其代谢产物残留分析方法研究进展[J]. 农药科学与管理, 2011, 32(3): 30－33.

[3] EROL C, ILHAN A. Effects of chronic carbosulfan exposureon liver antioxidantenzyme activities in rainbow trout [J]. Environmental Toxicology and Pharmacology, 2013, 36(1): 80－87.

[4] 杨清华, 史玉坤, 施逸岚, 等. 气相色谱-质谱联用测定蔬菜中克百威、三羟基克百威及丁硫克百威残留[J]. 中国卫生检验杂志, 2017, 27(11): 1539－1541.

[5] 方宗壮, 谢艳丽, 王萌, 等. 气相色谱-质谱法测定豇豆中丁硫克百威、克百威和3-羟基克百威的残留[J]. 保鲜与加工, 2016, 16(5): 94－99.

[6] 姚丽君, 杨璐, 代弟, 等. 液相色谱-串联质谱法同时检测蔬菜中克百威和3-羟基克百威残留[J]. 食品安全质量检测学报, 2017, 8(4): 1370－1375.

[7] 杨琳琳. 用高校液相色谱法测定番茄中的涕灭威、克百威等七种氨基甲酸酯农药的含量[J]. 农业开发与装备, 2015 (3): 79.

[8] 朴秀英, 吕宁, 林荣华, 等. 克百威、丁硫克百威和丙硫克百威登记现状及其潜在风险关注分析[J]. 农药科学与管理, 2015, 36(4): 10－16.

[9] 国家卫生和计划生育委员会, 国家食品药品监督管理总局, 农业部. 食品安全国家标准食品中农药最大残留限量：GB 2763-2016[S]. 北京：中国标准出版社，2016.

[10] 李彩均. 高效液相色谱法同时检测蔬菜中7种农药残留的方法[J]. 现代食品, 2017, (14): 97－100.

[11] 周嘉诚, 陈楠, 黎小鹏, 等. 高效液相色谱法测定葡萄中8种氨基甲酸酯农药残留[J]. 现代农业科技, 2016(8): 117－118.

[12] 阮卓卿, 黎小鹏, 李拥军, 等. 高效液相色谱法测定草莓中7种氨基甲酸酯农药残留[J]. 现代农业科技, 2014(13): 141, 146.

[13] 何亚斌, 施雅, 楼飞, 等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中克百威及其代谢物残留量[J]. 上海农业科技, 2013(1): 27－29.

[14] 宋禹, 张昌朋, 赵华, 等. 丁硫克百威、克百威和3-羟基克百威在小白菜、水稻和土壤中的分析检测方法[J]. 农药, 2014, 53(10): 739－741, 770.

[15] 张圆圆, 李二虎, 张武, 等. 高效液相色谱串联质谱法测定小麦和土壤中的丁硫克百威及其代谢物[J]. 农药科学与管理, 2014, 35(11): 32－35.

[16] 张鹏翔. 色谱分析中的检出限和测定下限及其确定方法[J]. 内蒙古科技与经济, 2009(6): 62－63.

[17] BK MATUSZEWSKI, CONSTANZER ML, CHAVEZENG CM. Strategies for the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC-MS/MS[J]. Analytical Chemistry, 2003, 75(13): 3019－3030.

Determination of Carbofuran and 3-Hydroxycarbofuran Residues in Mulberry

LI Guolie, JIANG Jinfang, SU Xu, QIN Mingli, DU Xin, HE Peirong, HE Jiaguo

(Nanchong Monitoring and Test Center for Agricultural Products Quality, Nanchong 637000, China)

An ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) assay for quantification of carbofuran and 3-hydroxycarbofuran, in mulberry was developed. The carbofuran and 3-hydroxycarbofuran were extracted by acetonitrile，purified by Carbon/NH2and analyzed with a methanol-0.1% formic acid solution-acetonitrile mobile phase. The residues of carbofuran and 3-hydroxycarbofuran were determined by multiple reaction monitoring (MRM) mode with positive electrospray ionization (ESI+)，and quantified by the method of external standard. The results showed that the calibration curves were good linear relationship between the ratio of the peak areas and the concentrations of from 1.00 to 200 µg/L and the correlation coefficient (R) was both more than 0.99. The limits of detection were 0.25 µg/kg and the limit of quantification were 1.00 µg/kg. The recovery, precision and matrix effect of this method, with 1.00－100 µg/kg additive amount, can meet the requirements of analytical method. This method was suitable for the determination of carbofuran and 3-hydroxycarbofuran residues in mulberry.

mulberry; carbofuran; 3-hydroxycarbofuran; residue; matrix effect; UPLC-MS/MS

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2018.02.13

TQ450.7

A

1009-6485(2018)02-0057-06

李国烈(1984—)，男，四川巴中人，农艺师，硕士，主要从事农产品质量安全检测工作，E-mail: glie2012@163.com。

2018-01-22。