三种生菜离体快繁的初步研究

李梅 陆玉建 边文静 张换换 石东里

摘要：以3种生菜子叶为外植体，研究了不同植物生长调节剂对生菜（Lactuca sativa）不定芽的诱导和植株离体再生的影响。结果表明，意大利生菜、玻璃生菜和结球生菜不定芽诱导最适培养基分别为MS+0.1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、MS+0.1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA和MS+0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；3种生菜生根最适培养基分别为1/2 MS+0.05 mg/L NAA、1/2 MS和1/2 MS+0.1 mg/L NAA。通过分析影响3种生菜高频离体再生体系建立的因素，为进一步利用基因工程技术开发功能性蔬菜奠定了基础。

关键词：生菜（Lactuca sativa）；离体快繁；植物生长物质；不定芽；生根；再生

中图分类号：S636.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）06-0111-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.06.028

Abstract： In this experiment，three kinds of cotyledons from Lactuca sativa were used as explants to study the effects of different plant growth substances on the induction of adventitious buds and the in vitro regeneration. The results showed that the optimal medium for the induction of adventitious buds from Lactuca sativa L. var. ramosa Hort.，Lactuca sativa L. var. crisha Hort. and Lactuca sativa var capitata L. were MS+0.1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，MS+0.1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，and MS+0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，respectively. The optimum rooting medium for the three kinds of Lactuca sativa were 1/2 MS+0.05 mg/L NAA，1/2 MS，and 1/2 MS+0.1 mg/L NAA. By analyzing the factors that affect the establishment of high-frequency regeneration system of three kinds of Lactuca sativa，it laid a foundation for further development of functional vegetables by using genetic engineering technology.

Key words： Lactuca sativa； rapid propagation in vitro； plant growth substance； adventitious buds； rooting； regeneration

植物疫苗将基因工程技术与机体免疫原理相结合，具有生产简单、成本较低、使用安全方便、易贮存等优点。转基因植物易于大规模生产外源蛋白，作为廉价的生物反应器展示了诱人的前景[1，2]。植物反应器本身不存在危害人类健康的因素，既安全又可靠[3]。利用转基因植物生产口服疫苗具有其独特的优势，植物细胞壁可以保护疫苗抗原免受胃肠道内环境的降解，从而使转基因植物生产口服疫苗成为可能[4]。生菜（Lactuca sativa）为菊科莴苣属草本植物，是一种广泛受到欢迎的绿叶蔬菜，整株可食、鲜嫩爽口、热量低，含有丰富的维生素及人体必需的矿物质，具有较高的营养价值[5，6]。生菜生长周期短，易繁殖，重组蛋白在其叶片中可以稳定储存和运输，并能通过口服途径被人体或动物机体有效吸收，因此是一种理想的转基因植物反应器[7-11]。稳定组织培养体系的建立是生菜遗传转化的重要基础和保证。生菜取材方便，易于离体培养，比较适合表达外源蛋白[12]。目前，有关生菜离体培养的研究较多，但生菜品种繁多，不同品种组织培养的条件不同，离体再生的效果存在明显的差异[13-15]。因此，有必要对生菜离体培养条件继续进行优化，从而建立稳定高效的生菜离体再生体系。

目前，有关玻璃生菜离体快繁的研究尚未见报道。本试验选用玻璃生菜、意大利生菜和结球生菜为材料，研究不同植物生长调节剂对3种生菜愈伤组织诱导和不定芽分化的影响，进而获得比较适合生菜高效再生的培养基类型，为今后生菜遗传转化体系的建立和品质的改良奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

意大利生菜（Lactuca sativa L. var. ramosa Hort.）、玻璃生菜（Lactuca sativa L. var. crisha Hort.）和结球生菜（Lactuca sativa var capitata L.）种子，由山东省黄河三角洲野生植物资源开发利用工程技术研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 培養基的配制

1）愈伤组织诱导和不定芽分化培养基。根据预试验的结果进行试验设计（表1），以MS培养基母液为基本培养基，添加不同浓度的6-BA（0.1、0.15、0.2和0.5 mg/L）和NAA（0.02、0.05、0.1、0.2 mg/L），调节pH至5.8。所有培养基均添加3%的蔗糖和1%的琼脂。

2）生根培养基的配制。以MS或1/2MS培养基母液为基本培养基，添加不同浓度的NAA（0.05和0.1 mg/L），调节pH至5.8，见表2。

1.2.2 种子的消毒和种植 生菜种子用10% NaClO消毒10 min，无菌水冲洗5～6次，然后将种子接种到1/2MS培养基固体中进行培养。生菜的生长条件为16 h光照/8 h黑暗，湿度保持在60%～70%，温度控制在25 ℃左右，光照度为2 000 lx。

1.2.3 生菜愈伤组织诱导和分化 以生长5 d的生菜子叶为材料，切成约0.5 cm×0.5 cm大小，接种到L1～L16培养基中，进行愈伤组织诱导和不定芽的分化培养。30 d统计愈伤组织诱导率，分化出芽的数量和芽分化率。愈伤组织诱导率=（产生愈伤组织的外植体数/接种数）×100%；不定芽分化率=（产生不定芽的外植体数/接种数）×100%。

1.2.4 再生根的诱导培养 当诱导产生的不定芽长度大约3～5 cm时，切取生长良好的不定芽，接种于生根培养基R1～R6中进行生根诱导，21 d后统计不定芽的生根率和根增殖系数。生根率=（产生不根的外植体数/接种数）×100%。

2 结果与分析

2.1 植物生长调节剂对外植体愈伤组织诱导的影响

将3种生菜的子叶接种于L1～L16培养基中，30 d后统计愈伤组织诱导率。结果表明，在上述培养基中，几乎所有外植体都可脱分化产生愈伤组织，但愈伤组织的生长情况却存在明显的差异。意大利生菜外植体在L4、L5、L9和L15培养基中，外植体产生的愈伤组织生长旺盛，堆积成团；而在L6、L7、L12和L16培养基中，诱导产生的愈伤组织量相对较少（图1A至图1D）。玻璃生菜在L2、L8、L10和L13中，子叶诱导产生的愈伤组织生长较旺盛，多为疏松的白色或淡绿色；而在L1、L4、L5、L6、L7、L9和L12中，子叶诱导产生的愈伤组织量较少，多为致密的淡绿色或乳白色（图1E至图1H）。结球生菜在L4、L8、L11、L13、L14、L15中，子叶诱导产生的愈伤组织生长较旺盛，多为疏松的白色；而在L1、L2、L5、L7、L12、L16中，子叶诱导产生的愈伤组织不明显，量较少，多为致密的淡绿色（图1I至图1L）。

2.2 植物生长调节剂对生菜不定芽分化的影响

生菜子叶诱导产生的愈伤组织继续培养，可分化产生不定芽。结果表明，意大利生菜在上述培养基中，愈伤组织分化效果最差的是L5，几乎观察不到明显的不定芽；其次是L1、L10、L13和L14，在这些培养基中，不定芽的分化率不到10.0%；愈伤组织分化不定芽效果较好的培养基为L7、L12和L16，不定芽的分化率达到80.0%以上，不定芽的数量较多，生长情况较好，其中L16培养基中愈伤组织分化产生不定芽的效果最好，不定芽分化率达到88.9%，不定芽数量多且生长旺盛（图1A至图1D）。玻璃生菜不定芽诱导率较高，但多数不定芽生长情况较差，存在严重的玻璃化现象。其中L2、L8、L13和L15不定芽分化效果较差，不定芽分化率大约在50.0%左右，芽小量少且玻璃化现象非常明显；L7和L9不定芽分化效果明显，不定芽数量较多，但玻璃化现象严重；L1、L12和L16不定芽诱导率几乎为100%，不定芽分化明显，数量较多，且玻璃化现象不明显，其中L12不定芽生长旺盛，效果最佳（图1E至图1H）。在这16种培养基中，结球生菜不定芽的诱导率都很高，几乎都为100%。其中，L8及L15的不定芽分化效果最差，芽少而小、长势差；在L3～L7、L9、L10、L13、L14中不定芽长势一般，出现玻璃化现象；在L1、L2、L11、L12、L16中，不定芽分化效果好，生长旺盛、芽多而大、质量好，相比之下，L2不定芽分化效果最好，不定芽增殖旺盛（图1I至图1L）。

2.3 植物生长调节剂对生菜不定芽生根的影响

将生菜不定芽接种到R1～R6培养基中，21 d后统计不定芽生根率。结果表明，意大利生菜在R5和R6培养基中，不定芽的生根效果较差，诱导产生的根不仅细而长，而且数量较少；在R1培养基中，不定芽诱导产生的根粗而长，但数量较少；R3和R4培养基中不定芽产生主根的数量较多，生根率较高，达到60.0%以上；在R2培养基中，不定芽生根率最高，接近75.0%，主根粗而长，数量较多，根系发达。玻璃生菜不定芽在R3培养基中生根率最低，主根短而少，效果最差；在R1培养基中，生根率低于50.0%，主根细而短，数量较少，根系不发达；在R2培养基中，不定芽生根率较高，但主根粗而短，数量较少，根系不发达；R4和R5培养基中，不定芽生根率低于50.0%，侧根较多，根系生长一般；R6培养基中，不定芽生根率达到53.8%，是培养基中生根系数最高的，主根细而长，侧根较多，根系发达。结球生菜不定芽在R1培养基中诱导产生的主根细而长，数量较多，根系较为发达，生根率约53.3%；R2中主根细而短，根系较差，生根率仅有18.8%；R3中主根粗而多，侧根少，根系生长一般，生根率约53.3%；R4中主根粗而长，侧根多，根系发达，生根率达到66.7%；R5中主根细而长，数量较多，生根率为60.0%；R6中主根细而长，数量较多，根系生长一般，生根率为57.1%。相比之下，在R4培养基中，结球生菜不定芽的生根效果最好。

2.4 3种生菜离体再生体系的建立

选择生长良好的3种生菜的子叶，分别接种于最适愈伤组织诱导和分化培养基中，7 d后可观察到外植体的表面产生少量乳白色的愈伤组织。继续培养至14 d，愈伤组织继续生长，增大增多，结构较致密，并有少量的绿色芽点产生（图2A、图2E和图2I）。21 d后，愈伤组织再分化效果明显，可以看到在子叶的表面产生数量较多的不定芽（图2B、圖2F和图2J）。继续培养至30 d，愈伤组织的数量基本不再增加，而不定芽继续增大增多。35 d后，不定芽生长明显，高而壮（图2C、图2G和图2K）。当诱导产生的不定芽长度约3～5 cm时，选择生长健壮的不定芽，接种于生根诱导培养基中进行生根诱导，3周后可以观察到不定芽的基部产生大量的不定根，进而获得试管苗（图2D、图2H和图2L）。

3 小结与讨论

利用植物生物反应器生产外源蛋白或可食性疫苗廉价、安全，具有独特的优势[16]。生菜不用加工处理，可以直接食用，是一种常用的植物反应器。高频离体再生体系的建立是植物遗传转化的前提和基础。目前有关生菜离体再生的研究虽有很多，但生菜品种不同，组织培养的条件也不同；即使是同一种生菜，种子的来源不同，离体再生的条件也存在差异[17，18]。迄今为止，生菜离体再生还存在不定芽分化率低，生根效果差，玻璃化比较严重等诸多不足之处。因此，筛选合适的生菜品种，建立稳定高效的再生体系已成为亟待解决的重要课题。本试验以3种生菜的子叶为外植体，进行离体再生条件的优化。结果表明，影响生菜愈伤组织诱导和分化的最主要因素是6-BA和NAA的浓度。当6-BA和NAA比例合适时，外植体诱导产生的愈伤组织量较少，结构较致密，再分化产生不定芽的效果较好，芽增殖系数高，不定芽数量多而大，生长旺盛；反之，外植体诱导产生的愈伤组织较多，堆积成团，结构疏松，多为非胚性愈伤组织，分化效果极差，芽小量少且玻璃化现象严重。3种生菜对6-BA和NAA比例要求不同，从意大利生菜、玻璃生菜到结球生菜，二者的比例逐渐提高。就3种生菜而言，在最适条件下，玻璃生菜和结球生菜不定芽诱导率较高，接近100%；而意大利生菜不定芽诱导率不到90%。其中玻璃生菜诱导产生的芽最多，但易玻璃化；结球生菜产生的芽量虽不如玻璃生菜，但玻璃化程度较轻；意大利生菜产生的芽则较少。在生根的研究中发现，当培养基为MS培养基，无论是否加入NAA，生根效果都较差，主根短而少，生根率低。当培养基为1/2MS培养基时，有利于3种生菜的生根。培养基不含NAA时，有利于玻璃生菜的生根，此时生根效果最好，根系发达；而意大利生菜和结球生菜还需加入一定浓度的NAA，方可有效的促进生根。通过对比3种生菜离体快繁的最适条件，初步建立起比较高效稳定的生菜离体再生体系，对于今后通过基因工程技术开发功能性蔬菜具有非常重要的意义。

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