瘦素对人乳腺癌MCF-7细胞DMBT1表达的影响*

魏 萌，司丽娜，陈 磊，程露阳，杨松鹤

（承德医学院基础医学院，河北承德 067000）

乳腺癌是严重威胁女性生命与健康的恶性肿瘤之一，在中国，乳腺癌发病率已占女性恶性肿瘤首位[1]。肥胖已成为世界范围内的公共健康问题，而肥胖已被证实与乳腺癌的发生、发展及转移密切相关[2]。瘦素是肥胖基因（obese gene，Ob）的产物，具有调节能量平衡、生殖、免疫、炎症、造血及细胞增殖等多种生物学作用[3]。研究显示，瘦素可通过正向调节雌激素的分泌，进而影响乳腺癌的发生发展[4]。DMBT1基因（deleted in malignant brain tumors）是一种候选的肿瘤抑制基因[5]，也有研究证实，DMBT1是受雌激素调节的基因[6]。基于上述研究结果，本研究观察了瘦素对雌激素受体阳性（ER+）乳腺癌MCF-7细胞DMBT1表达的影响，为进一步探讨DMBT1在雌激素受体阳性（ER+）乳腺癌中的生物学作用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂 雌激素受体阳性（ER+）的人乳腺癌细胞株MCF-7，由北京协和细胞资源中心提供。人瘦素重组蛋白，购自以色列ProSpec公司；DMBT1兔抗多克隆抗体（sc-28239），购自美国Santa Cruz公司；β-actin小鼠单克隆抗体（ab8226），购自英国Abcam公司；RPMI1640培养基，购自美国Gibco公司。

1.2 细胞培养 人乳腺癌MCF-7细胞接种于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素及100U/ml链霉素的RPMI1640培养基中，置于37℃、5%CO2孵箱中培养。

1.3 MTT法检测MCF-7细胞的增殖率 取对数期生长细胞接种于96孔板，调细胞浓度为1×104/孔，置37℃、5%CO2孵箱中培养使细胞贴壁。培养24h后，给予不通浓度人瘦素重组蛋白液（0ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml）作用于细胞24h，每个浓度设3个复孔，同时设调零孔和对照孔。采用MMT法用酶标仪于波长490nm处检测吸光值（A），计算增殖率。增殖率（PR）=实验组A值/对照组A值×100%。

1.4 蛋白印迹法检测MCF-7细胞DMBT1蛋白的表达水平收集实验组（瘦素800ng/ml，作用24h）及对照组（不含药物组）的细胞，提取总蛋白，蛋白定量后SDSPAGE（分离胶10%，堆积胶4%）电泳分离后电转（250mA，90min）至PVDF膜，一抗（DMBT1 1：500，β-actin 1：2000）4℃过夜，二抗孵育后化学发光法显色。图像扫描后采用Image J软件分析条带灰度，以DMBT1条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值作为DMBT1蛋白的相对含量。

1.5 统计分析 用SPSS 19.0软件进行统计分析，计量资料的比较采用单因素方差分析和t检，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖率 瘦素能明显促进MCF-7细胞增殖，随着瘦素浓度的升高，MCF-7细胞的增殖率逐渐升高（P＜0.05）。见附表：

附表 不同浓度瘦素作用24h对MCF-7细胞增殖率的影响

2.2 MCF-7细胞DMBT1蛋白表达的变化 蛋白印迹法结果显示，瘦素（800ng/ml）组中DMBT1蛋白含量为（76.99±0.26），明显高于对照组的（27.05±0.38），组间比较差异具有统计学差异（P＜0.05）。

3 讨论

众所周知，雌激素水平升高可提高乳腺癌的发病率[7]，而肥胖是绝经后妇女发生乳腺癌的另一个重要诱因[8]。研究显示，肥胖群体中的乳腺癌患者瘦素水平明显升高，而高水平的瘦素可促进雌激素依赖的乳腺癌细胞增殖[9]。DMBT1是由Molleuhancer等人发现的一种候选肿瘤抑制基因，该基因常在脑组织恶性肿瘤中丢失，故而得名。DMBT1表达下调、缺失、突变失活与多种肿瘤、特别是上皮细胞肿瘤的发生密切相关。在多种肿瘤中，如胃癌、肺癌，DMBT1表达与淋巴结转移、肿瘤浸润存在明显相关性[10-11]。目前，DMBT1与乳腺癌的关系还处于争论中，有研究显示DMBT1在乳腺癌中表达下调[12]；同时，有研究显示DMBT1也是一个受雌激素调节的基因，雌激素拮抗剂ICI182、780能抑制雌激素诱导的去势大鼠子宫内膜上皮细胞DMBT1 mRNA表达水平的升高[6]。本研究观察发现，瘦素作用下的雌激素受体阳性（ER+）的人乳腺癌MCF-7细胞，DMBT1蛋白的表达水平明显升高，说明瘦素可能通过正向调节雌激素的分泌，从而发挥对雌激素反应蛋白DMBT1的调节作用。但DMBT1在雌激素受体阳性（ER+）乳腺癌中的表达情况还需要进一步验证，以分析DMBT1能否做为乳腺癌诊断、治疗及预后监控的指标。

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