CXCR5+CD8+ T细胞在HIV感染中的免疫特征及其与疾病进展关系的研究

赵 爽，许 文，陈威巍，赵 敏

CXCR5+CD8+T细胞是一群被新定义的细胞群。不同于传统CD8+T细胞，这群细胞表达趋化因子受体CXCR5，通过CXCR5-CXCL13轴趋化其优先定植于B细胞滤泡中，构成了滤泡中的大部分CD8+T细胞，因而有研究将其定义为滤泡细胞毒性T细胞（follicular cytotoxic T cells,TFC）[1-4]。在慢性HIV感染期间，病毒复制集中于次级淋巴滤泡中，其中的滤泡辅助T细胞（follicular helper T cells,Tfh）是HIV感染和复制的重要位点[5-6]，传统的细胞毒性CD8+T细胞无法进入滤泡中，不能控制定植于淋巴滤泡内Tfh中的HIV感染。因此，CXCR5+CD8+T细胞的发现，可能对清除这一重要的HIV病毒库提供新的治疗靶点。

目前，对于CXCR5+CD8+T细胞在HIV感染疾病进程中的作用还存在争议。有学者认为CXCR5+CD8+T细胞是CD8+T细胞中的一群调节性细胞亚群，其在HIV及猴免疫缺陷病毒感染中可抑制Tfh的B细胞辅助功能，从而损害生发中心的应答，起到类似CD4+滤泡调节T细胞（follicular regulatory T cell,Tfr）的作用，因此定义其为CD8+Tfr[7]。目前对该群细胞的表型、免疫功能等的研究较少，且现有的研究还存在争议，其与HIV感染的关系有待进一步深入研究。本文拟对HIV感染中CXCR5+CD8+T细胞频率、功能变化及与HIV感染疾病进展的相关性进行研究，以探讨该群细胞在HIV感染免疫病理进程中发挥作用的可能机制。

1 对象与方法

1.1 对象 解放军第三〇二医院2015年10月—2017年5月收治的HIV感染者40例（HIV感染组）及同期体检的健康者15例（健康对照组）。HIV感染组中，男性35例，女性5例，平均年龄为（34.2±10.2）岁。HIV感染组纳入标准：①年龄18～60岁，自愿参加本研究者；②经HIV确证试验确诊的HIV感染者；③还未开始高效抗反转录病毒治疗（highly active antiretroviral therapy,HAART）；④无机会性感染；⑤无高血压、糖尿病等慢性疾病。排除标准：①妊娠妇女或产褥期妇女；②有其他免疫相关性疾病或使用免疫抑制剂者。健康对照组中男13例，女2例，平均年龄（38.1±13.1）岁。已排除妊娠妇女、产褥期妇女，以及既往无免疫相关性疾病或其他基础疾病者，入组前2周无急性感染性疾病，未使用免疫抑制剂。HIV感染组和健康对照组之间在性别（χ2=0.007，P=0.934）、年龄（t=0.778，P=0.337）方面差异均无统计学意义。

本研究已获得我院伦理委员会批准，入组的所有患者及健康者均签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂 FACS CantoII流式细胞仪、淋巴细胞亚群检测试剂盒、淋巴细胞绝对计数管、CD45-APC/Cy7、CD3-BV510、CD8-Percp/cy5.5单克隆抗体均购自美国BD公司。 CXCR5-FITC、IFN-γ-AF700、IL-10-PE单克隆抗体和固定破膜剂均购自美国Biolegend公司。淋巴细胞分离液购自德国GE Healthcare公司。HIV载量测定使用的全自动核酸分离纯化系统购自德国BIO-RAD公司（CFX96 Real-Time Ststem），HIV核酸定量检测试剂盒购自德国QIAGEN公司。

1.3 标本采集及外周血单个核细胞分离 采集研究对象清晨空腹外周静脉血4 ml，EDTA抗凝，使用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（peripheral blood monocytes,PBMCs）。

1.4 流式细胞染色

1.4.1 细胞表面标志物染色 将Ficoll密度梯度离心法分离的PBMCs计数，取1.0×106个细胞悬于含2%胎牛血清（fetal calf serum,FBS）的PBS缓冲液中，调整浓度为2.0×107个/ml。加入预混目的抗体组合和同型对照抗体组合，振荡混匀后室温避光孵育30 min；加入1 ml含2% FBS的PBS缓冲液，混匀后以1500 rpm离心5 min，弃去上清后重复1次；加入1%多聚甲醛400 μl固定，4 ℃避光存放；待流式细胞仪检测。

1.4.2 细胞因子检测 将Ficoll密度梯度离心法分离的PBMCs重悬于含有10%FBS的1640培养基并接种于96孔板中，使用50 ng/ml佛波酯和500 ng/ml离子霉素作为激活剂，激活后1 h加入高尔基阻断剂，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养4 h，回收细胞后加入1 ml含2%FBS的PBS，混匀后以1500 rpm离心5 min，弃去上清并加入固定破膜剂400 μl，4 ℃破膜30 min，其后加入破膜洗液1 ml，1500 rpm离心5 min，弃上清，加入IFN-γ流式抗体，避光孵育30 min，再用1 ml破膜洗液1500 rpm 离心5 min洗涤，加入1%多聚甲醛400 μl固定，4 ℃避光存放；待流式细胞仪检测。

1.4.3 流式细胞分析圈门策略 通过白细胞共同抗原CD45圈出淋巴细胞群，其后选定CD3+CD8+T细胞群，再从其中圈定CXCR5+的细胞群即CXCR5+CD8+T细胞，以及IFN-γ+和IL-10+的CXCR5+CD8+T细胞（见图1）。

1.5 血浆病毒载量测定 血浆HIV RNA载量检测采用实时荧光定量PCR方法，使用全自动核酸分离纯化系统（COBAS AMPLICOR）和核酸提取试剂盒，提取病毒RNA并测定病毒载量。操作过程严格按照试剂盒说明书进行。最低检测下限为40 copies/ml。

1.6 统计学处理 用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料呈正态分布，以±s表示。2组间均数的比较采用成组t检验（组间方差齐）。2组相关性分析采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CXCR5+CD8+T细胞及CXCR5-CD8+T细胞功能差异 健康对照组中，CXCR5+CD8+T细胞分泌IFN-γ高于CXCR5-CD8+T细胞，CXCR5+CD8+T细胞分泌IL-10也同样高于CXCR5-CD8+T细胞（图2A、B）。HIV感染组中，CXCR5+CD8+T细胞分泌IFN-γ和IL-10的能力均显著高于CXCR5-CD8+T细胞（图2C、D）。

2.2 HIV感染者CXCR5+CD8+T细胞频率及功能变化 流式细胞分析发现，HIV感染组患者外周血CXCR5+CD8+T细胞频率较健康对照组上调，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3A）；2组CXCR5+CD8+T细胞分泌IFN-γ的能力差异无统计学意义（P＞0.05）（图3B）。HIV感染组CXCR5+CD8+T细胞分泌IL-10的能力较健康对照组明显上调，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3C）。

图1 CXCR5+CD8+ T细胞流式分析Figure 1 CXCR5+CD8+ T cell subset analyzed by flow cytometry

图2 HIV感染组（n=40）及健康对照组（n=15）CXCR5+CD8+ T细胞和CXCR5-CD8+ T细胞功能差异A、B.健康对照组CXCR5+CD8+ T细胞及CXCR5-CD8+ T细胞IFN-γ及IL-10表达差异；C、D.HIV感染组CXCR5+CD8+ T细胞及CXCR5-CD8+ T细胞IFN-γ及IL-10表达差异Figure 2 Differences of the function of CXCR5+CD8+ T cells and CXCR5-CD8+ T cells in HIV infected group (n=40) and health control group (n=15)

图3 HIV感染组（n=40）及健康对照组（n=15）CXCR5+CD8+ T细胞频率及功能差异A.2组间CXCR5+CD8+ T细胞频率差异；B.2组间CXCR5+CD8+ T细胞IFN-γ表达差异；C.2组间CXCR5+CD8+ T细胞IL-10表达差异Figure 3 Differences of the frequency and function of CXCR5+CD8+ T cells between HIV infected group (n=40) and health control group (n=15)

2.3 HIV感染者外周血CXCR5+CD8+T细胞频率、功能与疾病进展的关系 本研究进一步分析HIV感染者外周血CXCR5+CD8+T细胞频率与CD4+T细胞计数和血浆HIV载量的相关性发现，CXCR5+CD8+T细胞频率与其外周血CD4+T细胞计数呈弱正相关（图4A），而与血浆HIV载量呈弱负相关（图4D）；CXCR5+CD8+T细胞IFN-γ的表达与其外周血CD4+T细胞计数无相关性（图4B），与血浆HIV载量呈负相关（图4E）。而CXCR5+CD8+T细胞IL-10的表达与外周血CD4+T细胞计数呈弱负相关（图4C），与血浆HIV载量呈正相关（图4F）。这些数据表明外周血CXCR5+CD8+T细胞频率及功能与HIV感染者的疾病进展密切相关。

图4 HIV感染组外周血CD4+ T细胞计数、血浆HIV载量与外周血CXCR5+CD8+ T细胞频率及功能的相关性A、B和C.CD4+ T淋巴细胞计数与CXCR5+CD8+ T细胞频率、IFN-γ表达及IL-10表达的相关性；D、E和F.血浆HIV载量与CXCR5+CD8+ T细胞频率、IFN-γ表达及IL-10表达的相关性Figure 4 Correlation of CD4+ T lymphocyte counts and plasma HIV load with the frequency and function of CXCR5+CD8+ T cells in peripheral blood of HIV infected patients

3 讨 论

目前HIV感染中CXCR5+CD8+T细胞群的免疫特征及其与疾病进展的关系尚不明确。本研究初步探索了CXCR5+CD8+T细胞的频率及IFN-γ和IL-10分泌功能，发现其频率及功能的变化与疾病的进展密切相关，提示其可能在HIV感染免疫致病机制中发挥了重要的作用。

此外，本研究还发现无论HIV感染者还是健康对照者，CXCR5+CD8+T细胞分泌IFN-γ的能力均较CXCR5-CD8+T细胞升高。新近的研究发现，利用T细胞过继转移治疗淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒慢性感染小鼠时，CXCR5+CD8+T细胞亚群比CXCR5-亚群表现出更好的治疗潜力[1]，且在慢性HIV感染中，CXCR5-CD8+T细胞位于T细胞区，受严重原位抑制性微环境的影响，表现出严重的功能障碍，也称为耗竭[8]，提示CXCR5+CD8+T细胞在慢性感染中可能发挥了更重要的抗病毒作用。本研究发现，未经治疗的HIV感染者中CXCR5+CD8+T细胞频率较健康对照组上调，其IFN-γ的表达在2组中的差异无统计学意义。而CXCR5+CD8+T细胞频率与外周血CD4+T细胞计数呈弱正相关，而与血浆HIV载量呈弱负相关，提示其对HIV感染病程可能起着控制作用。且该群细胞分泌IFN-γ的能力与血浆HIV载量呈负相关，也提示IFN-γ的分泌对控制病毒的复制发挥重要作用。

CXCR5+CD8+T细胞和CXCR5-CD8+T细胞的基因表达模式有较大差异[1]。本研究发现，CXCR5+CD8+T细胞在HIV感染组和健康对照组中分泌IL-10的能力均显著高于CXCR5-CD8+T细胞。CXCR5+CD8+T细胞群在HIV感染组中相对健康对照组也明显上调了IL-10的表达，且与外周血CD4+T细胞计数呈弱负相关，与血浆HIV载量呈正相关。近期研究发现，CXCR5+CD8+T细胞可损伤Tfh的功能及生发中心B细胞抗体的产生[7]，且既往研究发现CD8+T细胞的免疫抑制作用主要依赖于IL-10的分泌[9-10]，提示HIV感染可能通过上调CXCR5+CD8+T细胞的IL-10的表达抑制了生发中心应答，造成了HIV感染者体液免疫损伤，起到类似Tfr的作用[11]。另外也有研究发现，IL-10+的CD8+T细胞可通过分泌IL-10抑制IL-10-CD8+T细胞的增殖及IFN-γ的产生[9，12]。这提示高表达IL-10的CXCR5+CD8+T细胞可能也会损害CD8+T细胞分泌IFN-γ的功能从而抑制其抗病毒作用。以上研究结果提示，CXCR5+CD8+T细胞可能在HIV感染中发挥着复杂的免疫作用。CXCR5+CD8+T细胞群分泌较低IL-10和较高IFN-γ水平的HIV感染者，能更好地控制病毒复制并维持CD4+T细胞数量在较高水平。但是，目前对IL-10+CD8+T细胞发挥的功能还有争议，对羊毛硫氨酸合成酶2的研究发现其激活可能通过上调CD8+T细胞IL-10的表达，促进记忆CD4+T细胞和记忆CD8+T细胞的成熟，从而促进固有免疫向适应性免疫的转化[13]。对高表达IL-10的CXCR5+CD8+T细胞的功能还须进一步深入研究。

HIV病毒库难以清除是HIV治疗的一大障碍。而定植于淋巴滤泡中的Tfh因其对HIV高度易感以及HIV在滤泡中逃避了效应CD8+T细胞的作用而成为难以清除的HIV病毒库[5，14-15]。因此，进一步研究HIV治疗性疫苗与PD-1阻断剂或IL-2的联合使用，提高CXCR5+CD8+T细胞的免疫应答能力，可能为实现Tfh病毒库的清除提供新的途径。另外，将HIV特异的广泛中和抗体转移至非人灵长类及啮齿类动物中，均能发挥预防及治疗作用，但HIV感染者中仅有很少一部分能产生广泛中和抗体[16-17]，Tfh功能的受损可能是其体液免疫功能障碍的最主要原因，阻断CXCR5+CD8+T细胞对Tfh及生发中心B细胞的抑制作用，可恢复受损的HIV感染者的体液免疫功能，从而为疫苗诱导广泛中和抗体的产生提供了可能。

研究已经明确CXCR5+CD8+T细胞主要分布在次级免疫器官中，并发现其可能在清除Tfh病毒库及生发中心B细胞功能调节中发挥重要作用。而由于组织获取的方法有限，本研究仅限于HIV感染者外周血CXCR5+CD8+T细胞，因而不能很好地解释人体组织内的该群细胞免疫特点及其在HIV感染组中与健康对照组的差异。

综上所述，本研究发现HIV慢性感染者外周血CXCR5+CD8+T细胞频率和功能与疾病进展密切相关。提示该群细胞在HIV感染免疫致病中可能发挥了重要作用，为HIV感染免疫致病机制提供了新的解释。一方面，CXCR5+CD8+T细胞可能发挥了重要的抗病毒作用，另一方面其免疫负调控作用可能也损伤了HIV感染者生发中心的B细胞应答。通过进一步的深入研究，可能揭示HIV感染中CXCR5+CD8+T细胞、Tfh及生发中心B细胞的相互作用机制，并为HIV感染病毒库的清除及HIV疫苗的研制提供新的可能的方向。

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