顶花板凳果愈伤组织和芽诱导培养研究

张 萍，王 森，付国赞，蒋建林，唐 艳

（1.中南林业科技大学经济林培育与保护教育部重点实验室/经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，湖南 长沙 410004；2.河南林业职业学院园林系，河南 郑州 471002）

顶花板凳果（Pachysandra terminalis Sieb.et Zucc.）也称粉蕊黄杨（中国树木分类学）或顶蕊三角咪（中国高等植物图鉴）［1］。黄杨科板凳果属常绿亚灌木，茎稍粗壮，下部根茎状且布满长须状不定根，上部直立。叶薄革质，菱状倒卵形，似簇生状。花序穗状，白色，顶生。果卵形，长5～6 mm，花期为4～5月，产于甘肃、陕西、四川、湖北、浙江等地，日本也有分布［2］。生于海拔1 000～2 600 m山区杂林或沟谷，喜阴湿耐寒，呈零星团块状分布［1］。

顶花板凳果是“陕西七药”中的重要药材之一，全草可入药，味苦微辛，可作为治疗老年慢性支气管炎、风湿性关节炎等疾病的复方药［3］。国内外学者对顶花板凳果的化学成分进行了大量研究。1975年日本学者Kikuchi［4］首次从顶花板凳果中分离出的Pachysandra型孕甾烷甾体生物碱具有很好的抗肿瘤活性药效。2000年美国学者Funayama S等［5］从顶花板凳果中分离得到一个新化合物pachysamine-E（19）。2014年，王啸洋［6］从陕西产顶花板凳果中分离得到7个生物碱，包括3个新化合物：1α-6α，10β-dihydroxy-2，3，7，7，10α-pentamethyl-2-azabicyclo-［4，3，1］decan-9-one（38）、20α-dimethylamino-3β-senecioylamino-16β-hydroxy-pregn-5-ene（39）和 20α-dimethylamino-3βsenecioylamino-pregn-5-ene（40）。2016年，段宏泉［7］课题组从顶花板凳果中分离出9个新富贵草型生物碱（terminamines-K-S ）（42-50）。

顶花板凳果植株低矮，四季常青，生长旺盛，竞争力强，吸收有害气体能力强，免修剪，易管理，养护成本低，既可作为园林绿化地被植物，又可作室内盆栽观赏植物，目前在江苏、北京、上海等地已有引种开发利用［8］。严海燕［9］研究表明，顶花板凳果具有耐阴性较强、光适应性范围较广且抵抗低温寒冷的高度适应性的生理生化功能。杨淑红等［10］研究表明，林缘与林下交界处的BD2和BD4叶片中各种叶绿素含量均显著高于其他叶片，证明顶花板凳果喜半阴环境，宜栽植在林缘、半林下、阴坡及建筑物北侧半阴处，可与乔、灌木构成复层次绿化，起到良好的水土保持作用。于洋等［11］研究表明，顶花板凳果耐旱性最强，夏季可耐15～20 d干旱。

顶花板凳果生产上常用播种繁殖、分株繁殖、切茎扦插繁殖、压条繁殖［12］。王小平等［13］指出选沙质壤土和或河沙作为基质，6～7月间进行扦插，当年即可成为商品苗，经济效益高。但有关顶花板凳果的组织培养育苗少有报道，仅程水金等［14］研究富贵草（顶花板凳果）的离体快繁结果表明，小茎段在MS+6BA 5 mg/L+NAA 0.5 mg/L培养基中分化率最高，在1/2 MS+NAA 0.1 mg/L的生根效果最好，但未对组织培养的具体条件做详细探讨。植物细胞组织培养技术是一种能满足现代化农业需求的快速、便捷的繁殖方法［15］。本试验在前期研究基础上进一步探讨不同培养条件对顶花板凳果植物组织培养的影响，为顶花板凳果的组织培养育苗工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用2016年11月河南省洛阳市栾川县赤土店熊耳山采挖栽植顶花板凳果的当年生鲜嫩带芽茎段。

1.2 试验方法

1.2.1 不同外植体采样时间下的顶花板凳果组织培养情况测定 将在1月2日、3月3日、5月6日、6月2日采集的外植体，在同样培养条件下进行顶花板凳果愈伤组织和芽的诱导。每个处理30个样本，3次重复。对试验结果进行观察记录，统计外植体污染率、愈伤组织和芽的诱导率及生长情况。

1.2.2 不同消毒方式下顶花板凳果组织培养情况测定 取当年生鲜嫩带芽顶花板凳果茎段，用软毛刷轻轻刷洗茎部及腋芽处，用中性洗涤剂浸泡30 min，用流水冲洗4～6 h，置于无菌超净工作台上，备用。先用70%酒精消毒1 min，用无菌水冲洗3～4次，接着用灭菌剂浸泡，浸泡处理的时间按照单因子试验设计进行，设立3个不同处理：0.1% HgCl2处理5 min，4% 84消毒液处理0 min、0.1% HgCl2处理5 min，4% 84消毒液处理3 min、0.1% HgCl2处理5 min，4%84消毒液处理6 min，最后用无菌水冲洗6次，置于无菌滤纸上切成带顶芽或腋芽的1～3 cm小茎段，接种到诱导培养基上，每个培养瓶接种一个外植体。每个处理30个样本，3次重复。后期观察记录试验结果，统计外植体污染率、成活率和死亡率。

1.2.3 不同培养基下顶花板凳果组织培养情况测定 以MS为培养基，采用6-BA和NAA两种植物生长激素不同浓度处理的双因素试验，共设置6组浓度处理：6-BA 1 mg/L + NAA 0.5 mg/L、6-BA 1 mg/L + NAA 1 mg/L、6-BA 2 mg/L+ NAA 0.5 mg/L、6-BA 2 mg/L + NAA 1 mg/L、6-BA 3 mg/L + NAA 0.5 mg/L、6-BA 3 mg/L +NAA 1 mg/L，然后附加蔗糖30 g/L、琼脂5.2 g/L，pH调至5.8左右，每个处理30个样本，3次重复［16］。培养45 d，观察记录，统计愈伤组织及芽的诱导率及生长情况。

1.2.4 不同光照条件下顶花板凳果组织培养情况测定 接种后分别对培养基进行光照培养和暗培养。光照强度1 000 lx，光照时数14 h/d。暗培养采用报纸完全遮盖培养基，避光培养。2种处理均为静置培养，培养温度为25（±2）℃。接种2周后，每7 d进行1次试验观察，详细记录愈伤组织和芽的诱导情况，包括发生时间、颜色、质地、生长情况等。

试验数据用SPSS20.0统计软件处理。

2 结果与分析

2.1 不同采样时间对顶花板凳果组织培养的影响

由表1可知，顶花板凳果外植体不同采样时间情况下，其组织培养的诱导率、污染率及愈伤组织和芽诱导情况均有较大差异（图1～图4，封二）。5月是顶花板凳果外植体采样的最佳时期，诱导率最高、为44%，污染率最低、为11%，且愈伤组织和芽的生长状况最好，萌动和分化最明显；6月相对5月植物诱导率降低，污染率升高，分别为20%、35%；1月的诱导率最低、为10%，污染率最高、为84%；3月相对1月外植体诱导率增大、为37%，污染率相对降低、为33%。

表1 不同外植体采样时间对顶花板凳果组织培养的影响

2.2 不同外植体消毒方式对顶花板凳果组织培养的影响

由表2可知，0.1% HgCl2消毒5 min后再用4%84消毒液分别消毒0、3、6 min，随着4% 84消毒液处理时间的延长，污染率逐渐降低，死亡率逐升高，但是污染率下降不明显，死亡率差异较大，分别增加29、25个百分点，说明4% 84消毒液处理可达到消毒的效果，但其毒害作用也比较强，对外植体产生较大影响。因此，只用0.1% HgCl2处理5 min，是较好的外植体消毒方式。

表2 不同外植体消毒方式对顶花板凳果组织培养的影响

2.3 不同激素配比顶花板凳果组织培养的影响

生长素和细胞分裂素协同调控作用在植物组织培养中起到重要作用。研究结果表明，6个不同激素浓度配比培养基的顶花板凳果愈伤组织和芽的诱导率分别为16.7%、11%、47%、33%、27%、26.7%。其中6-BA 2 mg/L + NAA 0.5 mg/L处理的顶花板凳果愈伤组织和芽的诱导率最高、为47%。6-BA 1 mg/L + NAA 1 mg/L处理的顶花板凳果愈伤组织和芽的诱导率最低、为11%。当6-BA浓度保持不变时，愈伤组织和芽的诱导率随着NAA浓度的下降而下降；当NAA浓度保持不变时，愈伤组织和芽的诱导率随着6-BA浓度的增加呈先增加后下降的趋势。

2.4 不同光照条件对顶花板凳果组织培养的影响

本研究结果表明，光照处理与黑暗处理对顶花板凳果愈伤组织和芽的诱导有明显差异。接种后直接进行光照培养，愈伤组织发生快，长势好，大部分为嫩绿色，质地均匀蓬松，且出现较为明显的芽的萌动和分化，诱导率高达60%。接种后直接进行暗培养则愈伤组织发生极慢，长势差，大部分都褐化死亡，诱导率仅为4%，愈伤组织均为黄绿色，且没有明显的芽萌动和分化。

3 结论与讨论

本研究结果表明，在植物组织培养中，不同培养条件对组织培养的影响有较大差异。不同采样时间、外植体不同消毒方式、不同激素配比、是否光照处理等因素对顶花板凳果愈伤组织和芽诱导均有不同影响。这些差异会导致外植体生理生化状态差异，从而影响组织培养的形态建成。5月采集的当年生健壮无病虫害的幼嫩顶花板凳果带芽茎段作为外植体，顶花板凳果愈伤组织和芽的诱导情况最佳。此时，愈伤组织出愈快、长势好、质地均匀，芽有明显的萌动和分化。可能的原因是5月顶花板凳果春梢正处于大量萌发期，植物体内积累内源激素和营养物质较高，且植物体内的内部状态良好，因此愈伤组织和芽的诱导率较高［17-18］。1月外植体正处于休眠期，组织老化，生命力弱，故污染率高，且其新陈代谢缓慢，内源激素和营养物质相对缺乏，故诱导率也低。3月与6月采集的外植体诱导率和污染率均处于中间水平，原因可能是3月气温逐渐回暖，植物体的休眠逐渐解除，生命活力也渐渐恢复，抗菌抗病能力增强，故诱导率升高、污染率下降。6月相对5月外界温度升高和湿度均增大，微生物大量滋生，且顶花板凳果茎段更粗壮，表面积增大，导致在采样和组培操作时材料更易被污染。

外植体消毒是组织培养过程的至关重要环节，为防止污染发生，从选材和接种前准备、接种及培养阶段都投入了大量的人力、物力，既要保证外植体表面的微生物彻底被杀死，又要尽可能减少对外植体组织和表面细胞的伤害［19-20］。消毒药剂浓度不能太低也不能太高，消毒时间不能太长或太短，若杀菌剂浓度过高或消毒时间过长，植物细胞会启动自身的保护机智，不断产生大量次生物质，引起细胞毒害，产生褐化甚至死亡，导致外植体的死亡率增加［21］。本试验中，采用 0.1% HgCl2处理 5 min，而不用4% 84消毒液处理，就能达到较好的消毒效果，且死亡率相对较低。顶花板凳果外植体的消毒需要的时间较短，可能是材料在人工气候培养室生长，采集的外植体均较幼嫩，减少了和外界复杂环境的接触，所以携带的杂菌也较少。随着用4% 84消毒液处理时间的加长，对外植体的毒害也相应加深，外植体的活性也随之降低，导致死亡率增高。

在离体培养过程中，外源激素的种类、浓度及其组合配比诱导不同植物材料的不定芽效果不同［22］。NAA属于天然生长素，合成比较稳定的化合物，能促进组培苗节间的伸长［23］；6-BA是第一个人工合成的细胞分裂素，在植物形态发育中能促进细胞分裂，利于愈伤组织的形态建成［24］，还能促进芽分化、侧芽生长［25］。赵杨阳等［26］研究家独行菜愈伤组织的丛生芽诱导时发现，6-BA作为主效植物生长调节物质，当浓度为1.5 mg/L时诱导率高达89.9%，效果较好。诱导器官发生时生长调节剂中细胞分裂素和生长素的配比至关重要，当外植体中生长素含量较高而细胞分裂素含量较低时，越有利于愈伤组织的诱导。吴秀燕等［27］研究发现，6-BA和NAA共同使用对美国流苏茎段不定芽诱导效果较好，诱导率高达86.8%。本实验培养基中加入激素6-BA浓度为2 mg/L、NAA浓度为0.5 mg/L时，顶花板凳果愈伤组织和芽的诱导率最高，且愈伤组织和芽均有明显萌动，长势旺盛，愈伤组织质地均匀，呈嫩绿色。这与程水金等［14］研究结果不一致，可能是材料的来源不同及个体差异导致。

光作为一种物理因子影响外植体的脱分化、器官的发生和幼苗的形态建成及生长发育过程。主要通过人工调控光强度、光质、光周期等光环境因子，且考虑光与其他环境因子共同作用，来满足植物生长发育需要的光环境［28］。不同植物对光环境条件要求不一致，过高光强会抑制光合作用，导致光氧化，破坏光合作用器官；过低光强不利于植物的光合产物的积累和经济产物的提高，因为弱光导致植物消耗更多自身结构物质来扩大光能接受面积及增加光系统组分的能量［29］。本研究中光照培养顶花板凳果的愈伤组织及芽的诱导率比暗培养高54%，说明顶花板凳果更适用于光照培养。

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