肝素调控猪嗜中性粒细胞对精子的趋化和吞噬作用

李井春，李 琦，韩淑敏，张 帆，孙思怡，李雁冰，魏国生

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

猪在配种和人工授精 （artificial insemination，AI）后，有45%左右的精子通过子宫颈回流而丧失［1-2］。此外，大部分精子由于精液诱导的子宫局部免疫反应而被子宫内的嗜中性粒细胞（PMNs）清除［3］。虽然T淋巴细胞、巨噬细胞和PMNs是健康非怀孕猪子宫上皮中的主要白细胞类型，但在发情期和发情间期只有PMNs数量显著增加［4］。由人工授精引发的大量PMNs进入子宫腔［5］，AI后24 h内将生殖道精子数减少至1%［6］。目前，调控PMNs向子宫腔快速趋化移动和吞噬活性的机制还不清楚。

如何调控PMNs的快速趋化及对精子的吞噬，已成为人工授精技术研究的热点之一。有研究报道，咖啡因在一定程度上能够有效抑制PMNs对精子的趋化和吞噬作用［7］。此外，通常用作抗凝血剂的肝素可以刺激公牛精子获能，并且被证实可以抑制兔PMNs的吞噬作用［8-10］。然而，关于肝素对猪PMNs吞噬作用和公猪精子趋化性影响的研究鲜有报道。

该研究主要应用趋化小室检测猪嗜中性粒细胞对精子的趋化性，利用共培养方法检测PMNs对精子的吞噬性，以探究不同浓度的肝素对猪PMNs趋化和吞噬活性的影响。

1 材料与方法

1.1 药品和培养液

Histopaque-1077、肝素 （heparin）等均购自Sigma公司。采用TL-HEPES-PVA培养液进行体外培养试验 （由黑龙江八一农垦大学动物繁殖学实验室提供的改良配方配制）。

1.2 猪PMNs的准备

采用前腔静脉采血法，采集健康大白母猪（由黑龙江八一农垦大学猪场提供）血液10～20 mL，经柠檬酸盐抗凝处理后于4℃条件下保存，并在2 h内运回实验室；将血液在1 000×g、4℃条件下离心10 min，收集血浆和血细胞之间的白色PMNs层，置于15 mL干燥无菌离心管中，重复上述操作3次。收集含有PMNs的混合液用D-PBS稀释，并在4℃条件下以320×g离心10 min，取上清液用4 mL的PBS稀释，待用。将稀释的混合液小心放到预先制备的Histopaque-1077（3 mL）液面上并离心（400×g、30 min、25 ℃）。离心后，将上清液（主要包括巨噬细胞和淋巴细胞）去除，剩下的是PMNs和血细胞，用红细胞溶解液 （150 mmol/L NH4Cl、12 mmol/L KHCO3、0.13 mmol/L EDTA）溶解红细胞，直至将所有的红细胞溶解，剩下PMNs为止，最后用PBS洗涤3次，置于4℃冰箱中保存，备用。

1.3 精子的准备

通过手握法收集4头公猪（长白公猪）精液中富含精子的部分 （30～50 mL）。精液用改良的Modena溶液稀释5倍，在收集后2 h内将稀释后的样品运送到实验室。 通过离心（750×g，3 min）洗涤1次后，将精子以1×107细胞/mL的浓度重悬于TL-HEPES-PVA溶液中。分别利用LIVE/DEAD精子活力试剂盒和常规显微镜观察，发现精子的活率和活力分别为（91.5±1.8）%和（81.5±2.4）%，精子质量符合后续试验要求。

1.4 血清的制备

当采取黄体期的猪静脉血制备PMNs时，分别收集4头母猪的血浆，并在4℃下以1 000×g离心10 min。回收上清血清并在-20℃下储存直至使用。在56℃下热处理30 min使血清（5 mL）试样灭活，然后在-20℃下贮存，备用。

1.5 PMNs的吞噬试验

根据Matthijs等［11］报道的方法做部分调整。取四孔培养皿，加入PMNs以及含有不同浓度肝素（0、100、500、1 000 μg/mL） 的 TL-HEPES-PVA 培养液80 μL，之后培养皿中放入预先准备好的精子20 μL，与 PMNs液混合，PMNs和精子的最终浓度分别为 8×106细胞/mL和 2×106细胞/mL， 最后置于38.5℃、5%CO2的培养箱中培养60 min。向培养后的混合液中滴加100 μL的肝素充分混合，用移液器吸取少量样本制片，在400倍显微镜下观察PMNs的吞噬率 （每个样本至少观察200个以上的PMNs），最后计算PMNs对精子的吞噬率。

1.6 PMNs的趋化性测定

利用Blind well chamber进行PMNs的趋化性试验［12］。根据试验设计，在趋化小室的下层小室放入待测的样品（含精子、卵黄和猪精浆等）100 μL，之后放入膜孔径8 μm的膜（市售），然后安装趋化小室的上层并在上层添加100 μL含1×107细胞/mL PMNs的TL-HEPES-PVA培养液，最后将整个趋化小室放到38.5℃的CO2培养箱中培养90 min，培养完成后，取出趋化小室，弃去上层小室中的PMNs液，将孔径8 μm的膜取出，用PBS洗涤除去附着于膜表面的PMNs，置于载玻片上，自然干燥，然后用固定液固定15 min，风干后用吉姆萨染液染色20 min，然后用水漂洗至无残留液，再用固定液固定制片封存，待镜检。

2 结果与分析

2.1 不同浓度的肝素对猪PMNs吞噬性的影响

从图1可以看出，在血清存在的条件下，添加不同浓度的肝素可以降低血清刺激PMNs对精子的吞噬活性（P＜0.01）。随着肝素浓度的增加，PMNs的吞噬率呈下降趋势，当肝素浓度为1 000 μg/mL时，猪PMNs对精子的吞噬率最低。但是，在培养液中添加 100 μg/mL 和 500 μg/mL 肝素时，PMNs对精子的吞噬活性在二者之间没有显著差异 （P＞0.05）。

图1 不同浓度的肝素对猪PMNs吞噬精子活性的影响

2.2 不同浓度的肝素对猪PMNs趋化性的影响

从表1可以看出，当在培养室的上部添加100、500、1 000 μg/mL 的肝素进行趋化活性检测时，随着肝素浓度的增加，PMNs趋化性指数呈下降趋势（P＜0.05），而在添加量为 100 μg/mL 和 500 μg/mL肝素时没有显著差异（P＞0.05）。添加1 000 μg/mL肝素时，PMNs的趋化性指数最低 （P＜0.05）。

表1 不同浓度的肝素对猪PMNs趋化性的影响

3 讨论

研究表明，通过添加新鲜血清可显著刺激PMNs的趋化活性，但热灭活血清不会增加PMNs的趋化活性，因此，该研究利用新鲜血浆作为激活猪PMNs活性的激活剂。肝素在采集血液白细胞时通常用作抗凝血剂。肝素抑制PMNs吞噬作用的机制是肝素与质膜结合并屏蔽了配体，包括与PMNs结合的配体。在该研究中，肝素不仅显著降低了猪PMNs的吞噬活性，而且显著降低了PMNs的趋化活性，因此，似乎肝素抑制了PMNs的凝集与结合，也改变了PMNs的功能，从而降低其了迁移能力。肝素也被用做在体外诱导精子获能［8］。超活化是精子获能的标志［13-14］。非常活跃的精子可能难以被PMNs吞噬。然而，在该研究中，即使肝素仅在培养室的上部（含有PMNs），PMNs的趋化活性也显著降低。此外，当精子与PMNs共培养时，肝素对吞噬精子的PMNs发生率的影响较大，尤其是当肝素浓度为1 000 μg/mL时，PMNs对精子的吞噬率最低，因此，笔者推测吞噬精子的PMNs百分比下降，不是由于肝素诱导的获能引起的活化精子增加，而是由于肝素使得PMNs的活性降低。

参考文献：

［1］STEVERINK D W，SOEDE N M，BOUWMAN E G，et al.Semen backflow after insemination and its effect on fertilisation results in sows ［J］.Animal Reproduction Science，1998，54（2）：109-119.

［2］MATTHIJS A，HAKZE R，POSTMA A，et al.Leukocyte recruitment and phagocytosis of boar spermatozoa［M］//JOHNSON L A，GUTHRIE H D.BoarSemen Preservation Ⅳ.Lawrence：Allen Press，2000：35-41.

［3］WOELDERS H，MATTHIJS A.Phagocytosis of boar spermatozoa in vitro and in vivo ［J］.Reproduction Supplement，2001，58：113-127.

［4］KAEOKET K，PERSSON E，DALIN A M.The sow endometrium at different stages of the oestrous cycle：studies on morphological changes and infiltration by cells of the immune system［J］.Animal Reproduction Science，2001，65（1/2）：95-114.

［5］PURSEL V G，SCHULMAN L L，JOHNSON L A.Distribution and morphology of fresh and frozenthawed sperm in the reproductive tract of gilts after artificial insemination ［J］.Biology of Reproduction，1978，19（1）：69-76.

［6］FIRST N L，SHORT R E，PETERS J B，et al.Transport and loss of boar spermatozoa in the reproductive tract of the sow ［J］.Journal of Animal Science，1968，27 （4）：1037-1040.

［7］LI J C，FUNAHASHI H.Effect of blood serum，caffeine and heparin on in vitro phagocytosis of frozen-thawed bull sperm by neutrophils derived from the peripheral blood of cows ［J］.Theriogenology，2010，74 （4）：691-698.

［8］PARRISH J J，SUSKO-PARRISH J,WINER M A，et al.Capacitation of bovine sperm by heparin ［J］.Biology of Reproduction，1988，38（5）：1171-1180.

［9］VICTOR M，WEISS J，ELSBACH P.Heparin inhibits phagocytosisby polymorphonuclearleukocytes ［J］.Infection and Immunity，1981，32（1）：295-299.

［10］李井春，李雁冰，舟桥弘晃.猪精浆和卵黄调控体外牛嗜中性粒细胞对精子的趋化和吞噬活性的研究［J］.中国畜牧杂志，2013，49（11）：27-30.

［11］MATTHIJS A，HARKEMA W，ENGEL B，et al.In vitro phagocytosis of boar spermatozoa by neutrophils from peripheral blood of sows［J］.Journal of Reproduction and Fertility，2000，120（2）：265-273.

［12］李井春，李雁冰.咖啡因、双丁酰环磷腺苷调控体外猪嗜中性粒细胞对精子吞噬性的研究［J］.中国畜牧杂志，2013，49（3）：28-30.

［13］CHAMBERLAND A，FOURNIER V，TARDIF S，et al.The effect of heparin on motility parameters and protein phosphorylation during bovine sperm capacitation ［J］.Theriogenology，2001，55（3）：823-835.

［14］潘兴翠，张恒信，石传林.提高种公猪精液品质的技术措施［J］.黑龙江动物繁殖，2017，25（2）：11-12.