高效液相色谱-电感耦合等离子体-串联质谱法同时测定饲料中As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、氨苯胂酸和洛克沙胂

王 博， 张浩然， 陆 淳， 华贤辉， 曹 莹，晏绍庆， 徐 斐， 商 军*， 袁 敏*

(1.上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093；2.上海市兽药饲料检测所，上海 201103)

砷作为类环境金属元素，广泛存在于自然界。砷的有益性与毒性并存，研究表明[1]在允许浓度范围内，As2O3可抑制肿瘤细胞的生长，且低剂量的砷也会有健康效应。另外，大量研究表明[2 - 3]，无机态的亚砷酸盐(As(Ⅲ))和砷酸盐(As(Ⅴ))毒性较高，而在饲料中添加苯胂酸类有机胂制剂氨苯胂酸(p-ASA)和洛克沙胂(ROX)具有刺激动物生长、改善畜禽肉质等功效。但有机胂在饲料加工、储存和运输过程中可能降解为其他砷化合物，对人体和动物产生毒害作用。中国兽药典委员会在近期发布了“关于建议停止p-ASA等3种药物饲料添加剂在食品动物上使用”的公示。目前国内外对饲料中有关砷形态的研究较少，对砷形态的研究大多聚焦于海产品[4 - 5]、大米[6 - 7]等领域。为此，有必要建立一种测定饲料中砷形态的分析方法。

电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)技术是20世纪80年代迅速发展起来的一种分析测试技术，其主要应用于各种不同中药材中重金属及有害元素的测定[8 - 10]、食物样品中痕量重金属含量的测定[11 - 13]和水体中重金属含量的测定中[14 - 15]。目前高效液相色谱(HPLC)和电感耦合等离子体-串联质谱(ICP-MS/MS)联用技术已应用到许多领域中[16]，与HPLC-ICP-MS相比，HPLC-ICP-MS/MS在原有的检测基础上添加了一个质量过滤器，在检测砷形态方面能有效消除ArCl干扰，这使得其在检测砷形态方面具有更好的选择性。本文旨在建立HPLC-ICP-MS/MS法测定饲料中As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、p-ASA和ROX 4种砷形态的方法，为饲料中砷形态检测提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1260 Infinity高效液相色谱仪(美国，安捷伦股份有限公司)；8800电感耦合等离子体质谱仪(美国，安捷伦股份有限公司)；PK121R低温冷冻离心机(意大利，ALC公司)；SK5210HP超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；AL104电子天平(瑞士，梅特勒-托利多)。

无机砷标准品：As(Ⅲ):1.002 g/mL，As(Ⅴ):0.999 g/mL，均购于INORGANIC VENTURES公司。有机胂标准品：p-ASA:99%，ROX:99%，均购自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。各砷标准品使用前，用纯水配成1 μg/mL储备液,置于4 ℃条件下避光保存。甲醇(色谱纯，德国默克公司)；三氟乙酸(TFA，美国天地有限公司)，四丁基氢氧化铵(TBAH，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。实验用水由纯水机(重庆摩尔处理设备有限公司)制备。

1.2 样品前处理

取0.5 g饲料样品，置于50 mL离心管中，加入提取剂甲醇(1∶1)10 mL，超声1 h，冷却至室温，离心(9 000 r/min) 5 min，取上清液，残渣按上述步骤重复操作两次。将上清液合并后，用水稀释至50 mL，滤膜过滤后，上机测定。

1.3 仪器条件

HPLC条件：色谱柱：Shiseido MGⅡ C18柱(250×4.6 mm，5 μm)；柱温：室温；流速：1.2 mL/min；进样量：50 μL。流动相组成：A为甲醇-TBAH(6 mmol/L,pH=4.7),体积比为8∶92;B为甲醇-TFA(0.05%,pH=1.9),体积比为8∶92;梯度洗脱程序：0～10 min,100%A→100%B;10～26 min,100%B→100%A。

ICP-MS/MS条件：高频发射功率：1 600 W；载气：高纯氩气，流速0.93 L/min，补偿气流速0.2 L/min；蠕动泵转速：0.1 r/min；样品提升速度：0.5 r/min；采样深度：8 mm；采样锥：孔径1.0 mm，Pt锥；截取锥：孔径 0.4 mm，Ni锥；分析方式：脉冲、模拟，检测质量数：m/z75(As)、m/z91(AsO)。

2 结果与讨论

2.1 色谱分离条件的选择

图1 4种砷形态检测的色谱图Fig.1 Chromatogram of 4 arsenic species

流动相的组成、浓度和pH对As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、p-ASA和ROX的分离和保留具有显著影响，对于采用MGⅡC18色谱柱分离来说，pH对于各砷形态的分离影响最大。实验最终采用0.05%TFA(pH=1.9)、6 mmol/L TBAH(pH=4.7)和甲醇作为流动相，采用梯度洗脱方式在30 min内实现As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、p-ASA和ROX的良好分离，并且峰形对称、尖锐，灵敏度高。4种砷形态色谱图见图1。

2.2 质谱分析条件的优化

联机前将Agilent公司提供的调谐液(Ce、Co、Li、Mg、Tl和Y含量为1 g/L)稀释至1 μg/L对ICP-MS/MS进行调谐，以保证仪器的最佳状态和稳定性。砷的电离能较高，难以电离，采用高电离能1 600 W，保证各种砷形态的完全解离，同时调节采样深度、载气流速以及炬管位置，提高检测灵敏度同时降低氧化物和双电荷的比率，满足氧形态产率为CeO/Ce<1.5%，双电荷产率Ce2+/Ce+<2%。同时监测质量数75使其达最高灵敏度。

2.3 标准曲线及检出限

对浓度分别为0、0.5、1、5、10、20、50 μg/L的4种砷形态化合物混合标准溶液进行测定。以各砷形态的质量浓度(y)对峰面积(x)绘制标准曲线，各砷形态的线性范围、线性回归方程与相关系数见表1。配制估计检出限3～5倍的4种砷形态混合标准溶液，连续测定7次，求得其标准偏差。以3倍标准偏差所对应的砷质量浓度计算方法的检出限，结果见表1。结果表明，4种砷形态的线性回归方程相关系数均在0.9999以上，检出限在0.05～0.60 μg/L之间，可满足饲料中砷形态的测定需要。

表1 4种砷形态的线性方程式及检出限Table 1 The linear equations and detection limits of four arsenic species

2.4 前处理方法优化

实验选用了饲料原料、配合饲料、预混合饲料及浓缩饲料进行试验。由于饲料基质成分非常复杂，检测过程中基质干扰较大，为此选择了对样品进行稀释处理来减低基质干扰，并比较了不同提取溶液的提取效率。结果表明，As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的提取回收率随含水比例降低而降低，p-ASA和ROX提取回收率随含水比例降低而提高。饲料原料在不同提取液的提取效率见表2。提取方式比较了振摇和超声两种提取方式，试验表明两种提取方式均具有很好的提取效果，超声提取简单方便，适用于大量样品的前处理。最终选用甲醇-水(1∶1，V/V)作为提取液，超声提取1 h，使As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、p-ASA和ROX的提取回收率均符合我国国家标准《饲料中兽药及其他化学物检测试验规程》(GB/T 23182-2008)的要求。

表2 不同提取溶液的提取效率比较Table 2 Comparison of extraction efficiency of different extraction solutions

2.5 回收率与精密度

对采集的饲料样品(饲料原料、配合饲料、预混合饲料及浓缩饲料)进行加入回收实验。选用空白饲料基质，取As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、p-ASA和ROX混合标准溶液进行添加，每个添加水平取3个平行样，按照前处理方法进行提取和操作。实验结果表明，测得平均回收率范围为85.9%～104.6%，相对标准偏差(RSD)在1.2%～4.1%之间。饲料原料测试结果见表3。

表3 4种砷形态的添加回收率和精密度(n=6)Table 3 Spiked recoveries and precisions for four arsenic species (n=6)

2.6 样品分析

利用建立的方法对采集的饲料样品(饲料原料3批、配合饲料3批、预混合饲料3批及浓缩饲料3批)中的砷形态进行测定，并采用《饲料中总砷的测定》(GB/T 13079-2006)测定总砷，结果见表4。实验结果表明，除了配合料2和配合料3分别添加了有机胂制剂(p-ASA和ROX)外，其他饲料样品中砷主要以As(Ⅲ) 和As(Ⅴ)形态存在，其中复合预混合饲料2总砷测定结果为68.6 mg/kg，不符合《饲料卫生标准》(GB 13078-2001)中预混合饲料总砷规定的限量标准(≤10.0 mg/kg)。目前，p-ASA和ROX批准作为药物饲料添加剂可以使用，总砷减去饲料标签上标示的添加有机胂制量，折算后进行判断。本分析中，配合饲料2和配合饲料3经折算后符合《饲料卫生标准》(GB 13078-2001)中配合饲料总砷规定的限量标准(≤2.0 mg/kg)，而日常检测中，采用(GB/T 13079-2006)法测总砷后，再按饲料标签标示的添加有机胂量折算后很难进行判断，采用本法就能有效的进行判断。

表4 饲料中砷形态分析结果Table 4 Analytical results of four arsenic species in feeds

ND:not detected.

3 结论

建立了饲料中As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、氨苯胂酸(p-ASA)和洛克沙胂(ROX)4种砷形态的分离与检测方法，优化了样品前处理方法，保证了样品前处理过程中各砷形态的稳定。方法的检出限和精密度均能满足分析要求。该方法适用于饲料中常见的几种砷形态的检测，另随着“建议停止氨苯胂酸(p-ASA)和洛克沙胂(ROX)作为药物饲料添加剂在食品动物上使用”的公示发布后，该法也可提供重要的技术支持。

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