分子标记辅助选择改良水稻恢复系R389及其杂交种稻瘟病抗性

李永聪，黄 俊，廖 花，陈海龙，杨丰宇，赖怡帆，张旭辉，刘金灵，2，3，4，王国梁，2，3，4，刘雄伦，2，3，4

(1.湖南农业大学 农学院，湖南 长沙 410128；2.作物基因工程湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128；3.水稻油菜抗病育种湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128；4.南方粮油作物协同创新中心，湖南 长沙 410128)

由子囊寄生菌(Magnaportheoryzae)引发的真菌性病害-稻瘟病是造成全球水稻大面积减产的主要病害之一，也是目前我国水稻新品种审定中对其抗性要求实行“一票否决制”的病害。稻瘟病在我国时有发生，据相关报道，近年来年发生面积在330～570万hm2，稻谷年损失量超过10亿kg[1-3]。目前，生产上主要通过化学方法防治稻瘟病，而长期大量施用杀菌剂，极大地污染了环境和产品，同时增加了生产成本。利用抗圃广、抗性强且持久的抗瘟基因，培育抗稻瘟病水稻品种(组合)应用于生产实践，被认为是控制和防治稻瘟病危害最安全、经济和有效的策略[4-5]。分子标记辅助选择(Molecular Marker-assisted Selection，MAS)育种，是通过育种分离群体中个体的标记基因型选择替代传统的表型选择，根据标记基因型之间的差异，间接反映目的基因的有无，不受环境、基因显性上位性等因素的影响，是现代分子育种的重要手段，尤其适合水稻稻瘟病抗性这类典型质量-数量性状的遗传改良。来源于小粒野生稻(Oryzaminuta)的广谱持久抗稻瘟病基因Pi9，已经被精细定位并图位克隆[6]。

本研究根据抗性基因Pi9的Nbs2-LRR结构序列设计并筛选高效且特异性好的多态DNA分子标记，应用MAS技术和传统有性杂交育种技术，开展育种实践，定向改良优质两系水稻恢复系R389及其杂交种的稻瘟病抗性。

1 材料和方法

1.1 试验材料

栽培稻与小粒野生稻远缘杂交后代中选育出的含有广谱抗瘟基因Pi9的籼稻品系75-1-127，用作抗瘟基因Pi9的供体亲本及自然病圃稻瘟病抗性鉴定和室内接种抗谱分析的阳性对照材料；籼稻两系恢复系R389，用作抗性基因Pi9的受体亲本及轮回亲本；R389×75-1-127的高代BC6F1回交群体，用于分析获选DNA分子标记的辅助选择效率；温敏两系不育系P88s，用于配制两系杂交种P88s×R389和P88s×R389-Pi9；易感稻瘟病水稻品系CO39，用作稻瘟病抗性鉴定的感病对照材料；作物基因工程湖南省重点实验室收集保存的20份来自不同稻区的稻瘟菌菌株(表1)，用于室内接种，分析参试材料的稻瘟病抗性和抗菌谱。

1.2 试验方法

1.2.1 分子标记开发及标记基因型分析Pi9基因属典型的Nbs-LRR型蛋白编码基因，含有2个内含子，长度分别为5 362，128 bp；cDNA全长4 772 bp，包括763 bp 5′ UTR、3 099 bp CDS和910 bp 3′ UTR[7]。根据Pi9基因Nbs2-LRR结构序列信息，开发设计基于PCR技术的DNA分子标记，用于Pi9基因供体亲本75-1-127与轮回亲本R389之间多态性分析，并利用R389×75-1-127的高代BC6F1回交群体验证获选标记的辅助选择效率，应用获选高效特异性多态DNA分子标记开展分子标记选择育种实践。

取供试水稻材料分蘖期的幼嫩叶片约0.2 g置于2.0 mL离心管液氮速冻研磨，CTAB法提取总DNA[8]。用多态性分子标记分别PCR扩增各DNA样品，扩增产物经0.8%～1.0%琼脂糖凝胶电泳检测标记基因型。PCR反应体系(10 μL)：DNA模板1.0 μL，5 U/μL大连宝生物r-Taq0.1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.2 μL，0.2 μmol/μL primer pairs 1.0 μL，10×Buffer 1.0 μL，ddH2O 6.7 μL。PCR热循环参数：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 个循环；72 ℃ 7 min。

1.2.2 稻瘟病抗性鉴定及抗菌谱分析 室内接种抗性鉴定：接种水稻材料包括R389、抗病对照75-1-127和感病对照CO39，接种小种为本实验室收集保存的20份稻瘟菌菌株(表1)。参试水稻种子经选种消毒、干湿催芽后播种于温室内的花卉营养土中，期间进行常规管理，不施肥、不打药，四叶期分别用单孢密度约1×105个/mL的稻瘟病小种悬浮液进行喷雾接种，置于26 ℃、环境相对湿度大于90%的黑暗条件下培养24 h，之后于26 ℃、环境相对湿度大于90%条件下进行12 h黑暗-12 h光照条件交替培养7 d，诱导发病。发病等级调查及分类参照Bonman等[9]的标准进行(0～2级划分为抗病类型，3～5级划分为感病类型)，统计并计算R389、75-1-127和感病对照CO39的抗性频率(抗性频率=不致病菌株数/接种菌株总数×100%)。

田间病圃抗性表型鉴定：R389×75-1-127的BC6F1回交群体经室内催芽后于2015年5月14日播种于湖南浏阳大围山天然病圃，期间进行常规管理、不打农药。6月10日对个体苗期的稻瘟病抗感情况进行调查统计，并对抗、感单株叶片随机取样并编号，提取个体基因组DNA进行标记基因型分析，根据各单株田间抗病表型，结合单株标记基因型的鉴定结果，检验获选DNA分子标记的辅助选择效率；2015年5-6月于自然病圃对回交BC6F3群体各株系苗瘟抗性进行鉴定，9月对穗瘟抗性进行鉴定与评价，并根据基因型鉴定结果筛选出高抗稻瘟病纯系；2016年5-6月于同一天然稻瘟病病圃鉴定杂交种苗瘟抗性，9月鉴定穗瘟抗性。

1.2.3 MAS育种实践 MAS回交群体构建：以R389为Pi9基因受体亲本及轮回亲本，75-1-127为Pi9基因供体亲本，2010年在长沙(夏季)温汤去雄杂交获得R389×75-1-127的F1种子，2011年在三亚(春季)获得BC1F1，之后在两地穿梭加代，于2013年夏季获得BC6F1高代回交群体。各世代回交群体构建过程中，每代田间种植40～60株，抽穗前随机单株编号，提取DNA样品分析标记基因型，根据前景选择(分子标记鉴定)和背景选择(农艺性状考察)结果，选择10余个含有Pi9基因的单株进行回交，混合收种构成下一代回交群体。

抗病恢复系培育：2014年夏季对BC6F1群体中含有Pi9基因的个体套袋自交，获得BC6F2群体。2015年进一步对BC6F2单株做标记基因型鉴定，获得Pi9基因的BC6F3纯合株系，并根据病圃抗性鉴定结果和田间主要农艺性状考察结果，筛选出优良抗病恢复系。

抗病杂交种培育：2015年8月，选用1个遗传背景(主要农艺性状)与受体亲本R389非常相似的抗病纯系，与两系温敏不育系P88s配制P88s×R389-Pi9两系杂交种，同时用不育系P88s和受体亲本配制P88s×R389对照杂交种。2016年6-10月，在湖南农业大学耘园基地(长沙)进行小区评比试验，分析改良抗病恢复系及其杂交种的产量、株高等主要农艺性状。试验实行随机区组排列，设置3次重复，小区面积15 m2。室内催芽后于6月3日播种，7月1日分单株移栽，行距25 cm、株距20 cm，常规田间管理。每个小区定点取10个株，分单株调查分析全生育期、株高以及单株有效穗数、穗粒数、每穗实粒数、千粒质量等产量性状，相关记载标准参照文献[10]。采用Excel和SPSS软件分别对所得数据平均值进行统计分析和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 亲本水稻的稻瘟病抗性及抗菌谱分析

用20份来自国内外不同稻区的代表性稻瘟菌菌株，室内活体接种Pi9基因供体亲本75-1-127、受体亲本R389和感病对照CO39。结果表明，供体亲本75-1-127及受体亲本R389两者间抗性表现和抗菌谱均存在明显差异(表1)。抗性基因Pi9供体75-1-127对18份稻瘟病致病菌菌株拥有良好的免疫能力，表现为高抗，仅对日本小种KOH和韩国小种ROR1 2个小种无免疫能力，抗性频率为90.0%，抗谱广。受体亲本R389对9份菌株表现感病，对包括KOH、ROR1在内的11份菌株(87-4、193-1-1、195-2-2、CHL329、CHL438、CHL506、M2006123A1、RB5、KOH、GUY11、ROR1)表现抗病，抗性频率为55.0%，抗谱较窄。感病对照CO39对所有20份供试菌株均表现感病。另一方面，田间自然病圃抗性鉴定结果表明，75-1-127表现出高水平苗瘟及穗瘟抗性，而受体亲本两系恢复系R389高感苗瘟和穗瘟(表1、图1)。可见，Pi9基因广谱高抗稻瘟病，在水稻育种实践中应用前景广阔；而受体亲本R389的稻瘟病抗性差，需要改良。

2.2 高效分子标记Ins1-1的建立与应用

利用已发表的Pi9基因序列信息，在其第一个内元序列内设计了1对PCR引物(标记)Ins1-1(正向序列为5′-GTGGATATTCACCCGTTTCTTGCATG-3′，反向序列为5′-CACGATGATAACTTGGGCTAGGGC

G-3′)，引物覆盖区间为该内元序列的第360～872 bp。Ins1-1是一个显性DNA分子标记，在两亲本间多态性明显而稳定，在抗性基因Pi9供体亲本基因组DNA中扩增出一条大小为513 bp的明亮条带，而对受体亲本R389基因组无扩增产物(图2)。为验证Ins1-1的辅助选择效率，对R389×75-1-127 BC6F1群体中随机单株的标记基因型与抗瘟表型做了对应分析，结果表明，其选择效率为100%(图2)。利用Ins1-1这个获选的高效分子标记开展分子标记辅助选择育种实践，实现两系优质水稻恢复系R389及其杂交种稻瘟病抗性的定向改良。

图1 改良恢复系R389-Pi9及其杂交种的田间病圃抗性表现 Fig.1 Blast resistance performance of improved restorer R389-Pi9 and its hybrid in field nursery

菌株Isolate来源OriginR38975⁃1⁃127CO39(CK)87⁃4湖南RRS110⁃2湖南SRS318⁃2湖南SRS193⁃1⁃1湖南RRS195⁃2⁃2湖南RRSCHL329湖南RRSCHL438湖南RRSCHL440湖南SRSCHL446湖南SRSCHL506福建RRSM2006123A1福建RRSCHL645贵州SRSCHL1743广东SRSRB4广东SRSRB5广东RRSE2007046A2湖北SRSKOH日本RSSGUY11法国RRSKJ105韩国SRSROR1韩国RSS抗性频率/%55．090．00Resistancefrequency自然病圃抗病性NurseryresistanceSRS

注：R.抗病；S.感病。图2-3同。

Note：R. Resistant ；S. Susceptible.The same as Fig.2-3.

2.3 改良抗病恢复系及其杂交种培育

自2010年开始，以籼稻抗稻瘟病水稻品系75-1-127为抗性基因供体亲本、优质稻两系恢复系R389为Pi9基因受体亲本及轮回亲本，利用获选的特异性标记Ins1-1在长沙和三亚两地进行穿梭MAS育种，于2014年夏季获得R389×75-1-127的BC6F2回交群体，在此基础上经标记基因型鉴定，2015年春季获得26个含纯合Pi9等位基因的高代回交BC6F3株系。2015年于湖南浏阳大围山稻瘟病病圃对各株系的苗瘟和穗瘟抗性进行鉴定，结合分子标记选择与产量、株叶型等主要农艺性状的初步分析结果，从中筛选出1个高抗稻瘟病且遗传背景与受体亲本R389非常相似的改良恢复系R389-Pi9(图1，3)，并用它与温敏不育系P88s配制两系杂交种两优389-Pi9。2016年夏季在湖南农业大学耘园水稻实验基地(非病圃)进行的小区评比试验结果表明，改良的抗病系R389-Pi9及杂交种P88S/R389-Pi9的主要农艺性状及杂种优势表现，分别与对照R389及其杂交种P88S/R389在全生育期、株高、产量构成因素等性状表现上均无显著差异(表2)。田间天然稻瘟病病圃抗性鉴定结果表明，恢复系R389-Pi9和杂交种两优389-Pi9的苗瘟和穗瘟抗性均达到高抗水平，而R389和两优389高感苗瘟和穗瘟(图1)，实现了定向改良受体恢复系R389及其杂交种的目标。

A.表型鉴定结果；B.Ins1-1标记基因型鉴定结果：M.DNA ladder；1.75-1-127；2.R389；3～22.R389×75-1-127的BC6F1单株。A. Phenotypic identification result；B. Genotypic identification result by Ins1-1：M.DNA ladder；1.75-1-127；2.R389；3-22.R389×75-1-127 BC6F1 single plants.

A1.R389-Pi9表型鉴定结果；A2.R389-Pi9 Ins1-1标记基因型鉴定结果：M.DNA ladder；1.75-1-127；2.R389；3～22.R389-Pi9株系内随机取样单株；B1.杂交种两优389-Pi9的表型鉴定结果；B2.杂交种两优389-Pi9的Ins1-1标记基因型鉴定结果：M.DNA ladder；1.75-1-127；2.R389；3.两优389(对照)；4～24.两优389-Pi9随机单株。

A1. Phenotypic identification results of R389-Pi9；A2.Genotypic identification results of R389-Pi9 by marker Ins1-1：M. DNA ladder；1. 75-1-127；2.R389；3-22.Randomly sampled plants from R389-Pi9 family；B1. Phenotypic identification result of the hybrid Liangyou 389-Pi9；B2.Genotypic identification result of Liangyou 389-Pi9 by marker Ins1-1：M.DNA ladder;1. 75-1-127；2.R389；3.Liangyou 389(CK)；4-24. Plants of Liangyou 389-Pi9.

图3改良恢复系R389-Pi9及杂交种的表型与基因型鉴定

Fig.3PhenotypicandgenotypicidentificationoftheimprovedrestorerR389-Pi9anditshybrid

3 讨论与结论

稻瘟病菌引起的稻瘟病是危害水稻生产安全和影响稻米米质的主要病害之一，由稻瘟病所带来的经济和社会重要性，以及稻瘟病生理小种种族特异性及其在遗传上的可操作性，稻瘟病菌已逐渐成为研究抗性基因(R gene)与无毒基因(Avr gene)相互作用的模式真菌[11]。但由于稻瘟病生理小种的多样性和高度变异性，一定程度上限制了抗性基因和抗性品种的推广应用。因此，选用什么抗性基因进行品种改良，也会因为稻区的不同而有所差异。作为二期超级稻两优389的两系恢复系389具有株叶形态好、分蘖能力强、产量高、米质优、抗倒伏能力和抗寒能力强的优点，但感稻瘟病和白叶枯病[12]，因此，急需改良。Pi9基因是水稻第6号染色体上Pi2/9位点第1个被克隆的广谱持久抗瘟基因，对来自13个国家的43个稻瘟菌小种均表现出高水平抗性[6]。本研究利用广谱抗性Pi9基因开展MAS回交育种，定向改良优质水稻两系恢复系R389及其杂交种的稻瘟病抗性，育成了苗期和穗部发育时期高抗稻瘟病的改良纯系R389-Pi9及两系杂交种两优389-Pi9。但由于小区试验田的单一，试验代表性相对较差，将在此基础上，一方面，通过布置多点试验进一步验证改良恢复系及其杂交种在我国不同稻区的稻瘟病抗性表现；加快测优配组，培育更多抗病强优组合应用于生产；开发高效、特异性强的InDel共显性分子标记，以弥补应用Pi9基因进行MAS育种基因型鉴定繁琐的缺点。另一方面，由于稻瘟病生理小种(菌株)种族特异性及高度变异性，一定程度上限制了现有单一抗性基因(品种)的推广应用。作物基因工程湖南省重点实验室近年来同时利用具有互补抗圃的抗性基因Pi9、Pigm、Pi47、Pi48、Pi49、Pi2-1、Pi51等广谱抗瘟基因开展MAS育种，育成了大量抗病新材料新品系[13-17]，笔者正在开展多基因聚合育种，以期培育出抗谱和适应性更广的新品种(组合)。

表2 改良恢复系R389-Pi9及其杂交种的主要农艺及产量性状分析Tab.2 Main agronomic and yield traits analysis of the improved restorer R389-Pi9 and its hybrid

注：小写字母表示5%显著性差异。

Note：Lowercase letter indicates 5% significant difference.

分子标记是以DNA多态性为基础的遗传标记，是育种家们在长期的育种实践中不断衍生出来的，目前广泛应用于构建作物遗传图谱、定位重要农艺性状基因、分析种质资源的遗传多样性与鉴定品种指纹图谱和纯度等方面。辅助选择作为现代育种技术，相对传统育种而言，既高效、经济，又不受环境条件影响，而且分子检测样品不受种类、植株生长季节、部位组织等限制，操作相对简单。但目前利用分子标记辅助选择改良水稻稻瘟病抗性已有大量的研究报道，闫成业等[18]采用杂交、回交和分子标记辅助选择技术，将抗稻瘟病基因Pi9渗入到Q优6号的父本R1005中，育成了3个携带Pi9基因的株系，抗性较父本明显增强；姜思达[19]利用Pi9紧密连锁的分子标记定向改良了黑龙江主栽品种稻花香的稻瘟病抗性，改善了稻花香的品质；刘树芳等[20]利用与Pi9基因紧密连锁的分子标记结合分子标记辅助选择改良云粳优5号、云资粳41号和楚粳28等3份农艺性状优良水稻品种的稻瘟病抗性。但是，这些标记都是显性分子标记。尽管基于Pi9基因的共显性分子标记也有报道，如张羽等[21]基于Pi9基因的SNP共显性分子标记，能有效、准确地开展分子标记辅助选择育种；华丽霞等[22]、Tian等[23]基于PCR技术以及电泳检测技术的Pi2/Pi9的基因特异性共显性分子标记，有效地将Pi2/Pi9与该位点上的其他抗性等位基因及感病等位基因区分开。虽然这些标记都能有效地运用于分子标记辅助选择育种，但在不同品种间，选择效率存在差异。本研究中所获得的标记也属于显性分子标记，不能有效区分纯合子和杂合子，致使抗病纯系的选育周期延长。本实验室今后将针对Pi9基因开发出基于PCR技术的共显性分子标记，以弥补不能一次性区分纯合子与杂合子的不足。

本研究根据稻瘟病抗性基因Pi9的内含子序列信息，开发了一个高效显性DNA标记Ins1-1，利用该标记开展分子标记辅助选择育种，成功将Pi9基因导入水稻恢复系R389，从26份含Pi9纯合等位基因的BC6F3株系中筛选获得了一个遗传背景与受体亲本相当的高抗稻瘟病纯系R389-Pi9，并获得高抗苗瘟和穗瘟的两系杂交种两优389-Pi9。

参考文献：

[1] 龚 伟，李静波，黄安辉. 7种杀菌剂对稻瘟病的田间防效研究[J]. 现代农业科技，2016(4)：116.

[2] 刘占领，雷财林，程治军，等. 水稻稻瘟病抗性基因定位与克隆研究进展[J]. 作物杂志，2007(3)：16-19.

[3] 姜玉英，刘万才，陆明红，等. 2016年全国农作物重大病虫害发生趋势预报[J]. 中国植保导刊，2016(2)：32-33.

[4] Su J，Wang W，Han J，et al. Functional divergence of duplicated genes results in a novel blast resistance genePi50，at the Pi2/9，locus[J]. Theoretical & Applied Genetics，2015，128(11)：2213.

[5] 王 飞，王立广，潘梅瑶，等. 水稻抗稻瘟病Pigm(t)基因的分子标记辅助选择与利用[J]. 华北农学报，2016，31(1)：51-56.

[6] Liu G，Lu G，Zeng L，et al. Two broad-spectrum blast resistance genes，Pi9(t)andPi2(t)，are physically linked on rice chromosome 6[J]. Molecular Genetics and Genomics，2002，267(4)：472-480.

[7] Qu S，Liu G，Zhou B，et al. The broad-spectrum blast resistance genePi9 encodes a nucleotide-binding site-leucine-rich repeat protein and is a member of a multigene family in rice[J]. Genetics，2006，172(3)：1901-1914.

[8] 宋 敏，张云孙，胡卫红. 4种提取水稻基因组DNA方法的比较[J]. 云南大学学报：自然科学版，2001，23(1)：74-76.

[9] Bonman J M， Edios T I V，Khin M M.Physiologic specialization ofPyriculariaoryzaein the Philippines[J]. Plant Disease，1986，70(8)：767-769.

[10] 应存山. 中国稻种资源[M]. 北京：中国农业科学技术出版社，1993：530-531.

[11] Li Y，Zhang X E，Hu S，et al. PKA activity is essential for relieving the suppression of hyphal growth and appressorium formation by MoSfl1 inMagnaportheoryzae[J]. PLoS Genetics，2017，13(8)：e1006954.

[12] 王效宁，孟卫东，林尤珍，等. 两系超级杂交稻两优389在海南高产制种技术[J]. 杂交水稻，2010，25(5)：34-35.

[13] 文 婷，梁 毅，江 南，等. 利用Pi9基因序列标记辅助选择改良籼稻稻瘟病抗性[J]. 湖南农业大学学报：自然科学版，2012，38(3)：262-266.

[14] 梁 毅，杨婷婷，谭令辞，等. 水稻广谱抗瘟基因Pigm紧密连锁分子标记开发及其育种应用[J]. 杂交水稻，2013，28(4)：63-68，74.

[15] 曹 志，曾 盖，郝 明，等. 利用MAS技术改良水稻两用核不育系C815S的稻瘟病抗性[J]. 分子植物育种，2015，13(6)：1193-1200.

[16] 行 璇，刘雄伦，陈海龙，等. 分子标记辅助选择Pi9基因改良R288的稻瘟病抗性[J]. 作物研究，2016，30(5)：487-491.

[17] 杨丰宇，李永聪，刘雄伦，等. 分子标记辅助选择改良早籼稻1701的稻瘟病抗性[J]. 分子植物育种，2017，15(6)：2212-2217.

[18] 闫成业，马马渡·刚德卡，蒋胜理，等. 分子标记辅助选择改良杂交水稻Q优6号的稻瘟病抗性[J]. 杂交水稻，2014，29(1)：56-61，66.

[19] 姜思达. 黑龙江省水稻品种稻瘟病抗性基因Pi9的鉴定及稻花香稻瘟病抗性改良[D]. 哈尔滨：东北农业大学，2016.

[20] 刘树芳，董丽英，赵国珍，等. 抗稻瘟病基因Piz-t和Pi9连锁标记开发及在云南粳稻中的应用[J]. 西南农业学报，2016，29(4)：721-725.

[21] 张 羽，李厚华，王保军，等. 稻瘟病抗性基因Pi9的功能标记的开发[J]. 云南农业大学学报：自然科学版，2015，30(4)：528-534.

[22] 华丽霞，汪文娟，陈 深，等. 抗稻瘟病Pi2/9/z-t基因特异性分子标记的开发[J]. 中国水稻科学，2015，29(3)：305-310.

[23] Tian D G，Chen Z J，Chen Z Q，et al. Allele-specific marker-based assessment revealed that the rice blast resistance genesPi2 andPi9 have not been widely deployed in Chinese indica rice cultivars[J]. Rice，2016，9(1)：19.