2%双唑草腈颗粒剂液相色谱串联质谱的分析方法

张 月， 李 卫， 贾浩然， 李保同

(江西农业大学国土资源与环境学院，江西南昌 330045)

双唑草腈(pyraclonil)是由德国先令公司(现为拜耳公司)发现的双吡唑类除草剂，属原卟林原氧化酶(PPO)抑制剂，即当PPO活性被抑制后，原卟啉原Ⅸ无法氧化生成原卟啉Ⅸ，叶绿素合成受阻，从而导致植物死亡[1-2]。双唑草腈可被植物根、茎吸收，对稗草、续随子、鸭舌草、耳叶水苋、鳢肠和一年生莎草等有很高的活性，目前国内主要有2%颗粒剂登记用于稻田一年生杂草的防治[3-4]。有关双唑草腈制剂有效成分含量的检测方法已有高效液相色谱法[5]，而液相色谱串联质谱法尚未见报道。本研究采用液相色谱串联质谱法，以乙腈-0.1%甲酸水作流动相，能够很好地把杂质分离，快速准确地对双唑草腈进行定量。

1 材料与方法

1.1 试验仪器

高效液相色谱仪：Agilent 1260(配自动进样装置)，色谱柱为Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；过滤器：过滤膜孔径约0.22 μm；SB-5200DT超声波清洗器；质谱仪：Agilent 6120单级四级杆液质联用仪。

1.2 试验试剂

乙腈(色谱纯)购自西陇科学股份有限公司；甲酸(≥88%，色谱纯)购自天津市科密欧化学试剂有限公司；水(经二次蒸馏)；99.4%双唑草腈标样购自上海艾恩医药科技有限公司；2%双唑草腈颗粒剂购自湖北相和精密化学有限公司。

1.3 色谱操作条件

1.3.1 液相色谱条件 流动相为乙腈-0.1%甲酸水(体积比为55 ∶45)；流速为0.8 mL/min；柱温为30 ℃，进样体积为10 μL。

1.3.2 质谱条件 ESI离子源为正离子扫描；毛细管电压为3 000 V；干燥气(氮气)流速为 12 L/min；雾化气压力为241.32 kPa；干燥气温度为350 ℃；分子质量范围为70～350；碰撞诱导解离电压为100 V；阙值为70；增益为10.00；相对驻留为100%；选择性离子检测(selected ion monitor，简称SIM)质荷比(m/z)设定为315.2。

1.4 测定步骤

1.4.1 标准溶液的配制 称取双唑草腈标准品0.01 g(精确至0.000 1 g)置于50 mL容量瓶中，用乙腈溶解，超声波水浴助溶10 min，冷却至室温后，用乙腈定容并摇匀；取1 mL药液置于50 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度并摇匀；再取1 mL稀释液置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度并摇匀，过孔径0.22 μm的滤膜，备用。

1.4.2 试样溶液的配制 称取2%双唑草腈颗粒剂0.50 g(精确至0.000 1 g)置于50 mL容量瓶中，用乙腈溶解，超声波水浴助溶10 min，冷却至室温后，用乙腈定容并摇匀；取1 mL药液置于 50 mL 容量瓶中，用乙腈稀释至刻度并摇匀；再取1 mL稀释液置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度并摇匀，过孔径0.22 μm的滤膜，备用。

1.4.3 分析测定 在“1.3”色谱操作条件下，待基线稳定后，连续注入数针标样溶液直至相邻2针的丰度变化小于1.5%后，按标准溶液、试样溶液、试样溶液、标准溶液的顺序进样测定，用外标法分别计算双唑草腈含量。双唑草腈色谱见图1。

1.5 计算

测得标样溶液和试样溶液中双唑草腈的丰度，计算试样溶液中双唑草腈的质量分数W2(%)。计算公式如下：

式中：A1为双唑草腈标准品丰度；A2为试样中双唑草腈丰度；m1为双唑草腈标准品称样量(g)；m2为试样称样量(g)；W1为双唑草腈标准品的质量分数(%)。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

参照文献[5]，以双唑草腈标准品为研究对象，分别考察乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液流动相对双唑草腈标准品色谱分离的影响。结果表明，采用乙腈-水为流动相时，响应值偏低，峰形展宽，出现较多干扰小峰；采用乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相可得到较好的峰形，能有效去除色谱柱中的杂质残留，提高离子化效率，优化峰形，使灵敏度迅速提高。因此，最终以乙腈-0.1% 甲酸水溶液作为流动相。

为避免杂质对检测结果的干扰，提高检测效率，对乙腈-0.1%甲酸水溶液的体积比进行优化。结果表明，当乙腈和0.1%甲酸水溶液体积比为55 ∶45时丰度最大(表1)。

2.2 质谱条件的优化

为优化质谱检测参数，选择全扫描检测(Scan)模式，采用ESI离子源正离子和负离子模式对浓度为1 mg/L的双唑草腈标准溶液进行扫描。结果表明，正离子模式下信号丰度远高于负离子模式，从而确定离子源为正离子扫描，进一步确定扫描的分子量范围为70～350。再选择SIM模式进行定量分析，确定被监测的离子质荷比为315.2。对离子、 碰撞诱导解离电压等参数进一步优化，最终确定了“1.3.2”中的质谱条件。

表1 乙腈-0.1%甲酸水溶液体积比对保留时间和丰度的影响(双唑草腈0.4 mg/L)Table 1 Effect of volume ratio of acetonitrile-0.1% formic acid water on retention time and peak area (pyraclonil 0.4 mg/L)

2.3 方法线性相关性的测定与检出限

在确定的色谱和质谱条件下，分别配制6个不同质量浓度的双唑草腈标准溶液(0.02、0.04、0.12、0.20、0.40、0.80 mg/L)，采用外标法定量，以进样质量浓度为横坐标、丰度为纵坐标，求得线性方程为y=3×106x+68 852，r2=0.999 4，具有良好的线性关系(图2)。

不同浓度双唑草腈标样溶液按照文中“1.4”条件进行检测，使信噪比在3.0(S/N=3)左右时，即为最低检出限(LOD)。本试验中双唑草腈的质量浓度为0.002 5 mg/L时，信噪比为2.6，即该方法双唑草腈的LOD为2.5×10-8mg。

2.4 精密度测定

由表2可知，同一2%双唑草腈颗粒剂中准确称取5份试样，双唑草腈颗粒剂的标准偏差为0.027，变异系数为1.22%，符合国际农药分析协作委员会(CIPAC，<1.71%)的要求。

表2 2%双唑草腈颗粒剂精密度测定结果Table 2 Precision measurement results of pyraclonil 2% GR

2.5 准确度测定

由表3可知，称取6份已知含量的2%双唑草腈颗粒剂(2.01%)试样于50 mL容量瓶中，分别加入一定量的双唑草腈标准溶液，双唑草腈的回收率为98.10%～101.04%， 平均回收率为 99.51%，相对标准偏差为0.471%。

表3 2%双唑草腈颗粒剂准确度测定结果Table 3 Accuracy determination results of pyraclonil 2% GR

3 结论

建立以液相色谱串联质谱测定2%双唑草腈颗粒剂的定量分析方法。该方法操作简便，保留时间适中，与杂质分离彻底，精密度和准确度较高，线性关系良好，是双唑草腈制剂较为理想的检测分析方法。