无标记筛选G-四链体小分子配体的荧光新方法

任有良， 刘道广， 张 悦， 温 恒， 乔成芳， 刘 萍*

(1.商洛学院化学工程与现代材料学院，陕西商洛 726000;2.陕西省尾矿资源综合利用重点实验室，陕西商洛 726000)

端粒DNA(GDNA)是富含G碱基的高度保守的重复核苷酸序列，在K+、Na+等阳离子以及一些药物小分子的存在下，通过Hoogsteen氢键形成稳定的G -四链体结构[1-4]。研究表明，能够诱导端粒DNA形成G -四链体结构的小分子化合物具有重大的抗肿瘤意义，而以G -四链体为抗肿瘤药物作用靶点筛选配体的方法是目前研究的热点。

寻找以端粒DNA为作用靶点，毒性低的抗肿瘤药物引起了科研工作者的极大的兴趣。目前人们采用紫外吸收光谱、荧光光谱、电化学、圆二色光谱、核磁共振波谱、X-射线衍射、表面等离子体共振等多种方法[5-10]，从不同角度来研究GDNA与小分子配体的相互作用。荧光光谱法具有操作简单、灵敏度高、响应速度快，尤其是已经被广泛应用的基于构型转换的荧光共振能量转移(FRET)方法是研究GDNA与配体之间作用机理的一个重要方法。Simonsson和SjÖback研究小组[6]在单链GDNA的两端分别标记荧光基团和猝灭基团，在一些金属离子或者四链体配体的作用下，GDNA自身折叠形成G -四链体，引起荧光共振能量转移导致荧光强度减低，可以通过荧光强度的变化来检测G -四链体的形成。Jin等[11]基于荧光共振能量转移，用纳米金作为猝灭剂，5′标记荧光素(FAM)的人端粒DNA(F-GDNA)作为探针，设计了一端标记的、简单快速地筛选G -四链体配体的方法。虽然GDNA与小分子配体的荧光分析方法有很多，但是这些方法大多需要荧光标记，操作复杂，仪器昂贵，成本较高。因此非常有必要建立一些简单、快速并且能够被广泛应用的方法来筛选与G -四链体作用的配体。

中药单体是天然化合物的提取物，研究发现一些中药单体像槲皮素、芦丁、白杨素、大豆苷元等黄酮类化合物[12-15]对肿瘤治疗有一定的化学预防作用。本文以天然抗肿瘤中药单体槲皮素作为研究对象，基于GDNA结构的转变，构建了一种无标记荧光方法考察GDNA与槲皮素的相互作用，根据N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)/GDNA体系中加入槲皮素前后荧光强度的变化，快速有效地筛选能够诱导GDNA形成G -四链体结构的药物，为抗肿瘤药物的开发和研究以及肿瘤的临床治疗等提供重要的。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-4600型日立荧光分光光度计(日本，日立公司)；UV-1600PC型紫外-可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；pHS-3C型pH计(上海精密科学仪器有限公司)；TGL-18C离心机(上海安亭科学仪器厂)。

人端粒DNA(F-GDNA)：(5′-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGG-3′)，RDNA:(5′-GTTCATGCCGCCCATGCTCG-3′)由上海生物工程有限公司合成，用TE缓冲溶液(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH=7.2)配制成100 μmol/L的储备液；槲皮素、芦丁、大豆苷元、黄连素、木犀草素、山奈酚、苦参碱、绿原酸、黄连素、熊果酸等(上海金穗生物科技有限公司)均用无水乙醇溶解，用超纯水配制成浓度为100 μmol/L的母液；NMM(北京百灵威科技有限公司)、EDTA、无水乙醇等所用试剂均为分析纯。实验缓冲体系为pH=7.2的10 mmol/L Tris-HCl；用水均为Milli-Q(18.2 MΩ·cm)超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1荧光光谱法取100 μL 5 μmol/L NMM溶液于微量比色皿中，测量其荧光光谱。向NMM溶液中加入1 μL 100 μmol/L GDNA，混合均匀后放置15 min，测定其荧光强度(F0);然后向体系中加入2 μL浓度为100 μmol/L槲皮素溶液，混合均匀后放置30 min，测定其荧光强度(F)。

激发光源采用氙灯激发，激发波长λex为610 nm，发射波长λem为600～700 nm，激发与发射光狭缝均为10 nm，光电倍增管电压950 V。

1.2.2紫外-可见吸光光谱法移取2 mL 8 μmol/L NMM溶液于1 cm为石英比色皿中，测量其紫外光谱。向NMM溶液中加入5 μmol/L GDNA，混合均匀后放置15 min，测量其紫外光谱，然后再分别加入浓度为2 μmol/L和10 μmol/L的槲皮素溶液，混合均匀后放置30 min，进行紫外检测。

2 结果与讨论

2.1 实验原理

NMM是一种特殊的阴离子卟啉化合物，能够与G -四链体特异性结合，而对单链、二链体、三链体都无特异性结合[16-17]。NMM游离状态时，荧光强度微弱，但NMM与G -四链体结合后，荧光强度显著增强[18-19]。NMM已经广泛应用于DNA[20]、核酸酶[18]和一些生物小分子检测。本文基于NMM与G -四链体的特异性结合，通过考察槲皮素与NMM/GDNA 作用前后体系荧光强度的变化，实现筛选 G -四链体小分子配体的目的。实验原理见图1。

图1 无标记筛选G -四链体小分子配体的实验原理Fig.1 Schematic illustration of label-free screening small molecule ligands of G-quadruplex

2.2 实验可行性分析

2.2.1荧光光谱为验证方法的可行性，我们选取槲皮素作为研究对象，分别测量了NMM、NMM/GDNA、NMM/GDNA+槲皮素体系的荧光强度。结果如图2所示，NMM溶液荧光强度很低，当与 GDNA结合后，NMM的荧光强度有所增加，可能是NMM的环境改变引起，加入槲皮素配体后，体系的荧光强度明显增强。可能是槲皮素诱导GDNA形成G -四链体结构，NMM嵌入G -四链体结构中后使体系荧光强度大大增强。

为验证实验体系荧光强度的增加是因为槲皮素与GDNA相互作用形成了G -四链体，选择了一条对照链RDNA，这条链含有少量鸟嘌呤G碱基，在其它条件不变的情况下，将GDNA换成RDNA，研究不同浓度槲皮素对NMM/RDNA的荧光强度的影响。结果表明，不同浓度的槲皮素不能使NMM/RDNA体系荧光强度增加。只有在NMM/GDNA体系里加入槲皮素，荧光强度才有明显的增加，这与实验原理相符合，即槲皮素能够诱导单链的端粒DNA折叠形成G -四链体，从而使体系的荧光强度大大增强。

为进一步验证实验原理，还考察了一种生物碱类小分子苦参碱(Matrine)与NMM/GDNA体系的作用，在其它条件不变的情况下，研究不同浓度苦参碱对NMM/GDNA的荧光强度的影响，实验所取条件与槲皮素相同，结果如图3所示。从图中可以看出，在NMM/GDNA体系中加入2、4、6、8和10 μmol/L的苦参碱以后，体系的荧光强度几乎没有改变，说明苦参碱不能诱导GDNA形成G -四链体结构。结果表明，苦参碱也不能使体系荧光强度增加，只有在NMM/GDNA体系中加入槲皮素，才能使体系的荧光强度得到增强，进一步说明槲皮素能够诱导GDNA形成G -四链体。

图2 NMM/GDNA体系与槲皮素作用的荧光光谱Fig.2 Fluorescence emission spectra of NMM/GDNA+Quercetina:5 μmol/L NMM;b:5 μmol/L NMM+1 μmol/L GDNA;c:b+2 μmol/L Quercetin.

图3 NMM/GDNA体系与苦参碱作用的荧光光谱Fig.3 Fluorescence emission spectra of NMM/GDNA+Matrinea:NMM;b:NMM/RDNA;c - g:2,4,6,8,10 μmol/L Matrine.

2.2.2紫外-可见吸收光谱实验还采用紫外-可见吸光光谱法来考察槲皮素与GDNA之间的相互作用。实验结果如图4所示，可以看出在NMM/GDNA体系中加入槲皮素后体系的吸收光谱发生了减色现象，可能是配体与G -四链体的氢键对发生π电子堆积，配体嵌插到G -四链体结构中，插入的配体π*空轨道与碱基的π电子轨道发生耦合，耦合后π*轨道因部分填充电子，使π-π*跃迁几率减小，产生了减色效应[5]。吸收光谱变化越大减色效应越明显，表明嵌入程度越强。实验结果也说明了槲皮素能诱导GDNA形成了G -四链体结构，并嵌插入G -四链体中从而引起减色效应。

图4 不同浓度的槲皮素与GDNA/NMM体系的紫外-可见(UV-Vis)吸收光谱Fig.4 UV-Vis absorption spectra of GDNA/NMM with different concentrations of Quercetina:8 μmol/L NMM;b:5 μmol/L GDNA;c:2 μmol/L Quercetin;d:8 μmol/L NMM+5 μmol/L GDNA;e:d+2 μmol/L Quercetin;f:d+10 μmol/L Quercetin.

2.3 实验条件的优化

2.3.1稳定时间的选择实验考察了槲皮素与NMM/GDNA体系荧光强度随时间的变化关系。5 μmol/L NMM+1 μmol/L GDNA，混匀放置15 min，向该体系中加入2 μmol/L槲皮素后，每隔5 min测量该体系的荧光强度。结果显示随着作用时间的增加，体系荧光强度逐渐增加，但到30 min时，荧光强度变化趋于稳定，说明槲皮素与NMM/GDNA已经充分作用，实验选择混合30 min后测定。

2.3.2NMM浓度的选择NMM的浓度对传感器的荧光信背比产生显著的影响。为了优化实验条件，考察了不同浓度NMM对体系荧光强度变化的影响。结果可以看出随着荧光染料的浓度逐渐增加，传感器的荧光变化值逐渐增加，当浓度增加为5 μmol/L后，传感器的荧光强度变化达到最大。若继续增加的浓度，传感器的背景信号也会增大，荧光强度变化反而减小，实验选择NMM的浓度为5 μmol/L。

2.4 槲皮素浓度变化对 NMM/GDNA体系荧光强度的影响

实验考察了槲皮素浓度与NMM/GDNA体系荧光强度变化之间的关系。结果如图5(A)、5(B)所示。从5(A)可以看出：随着槲皮素浓度逐渐增加，体系的荧光强度也在增强，这说明槲皮素的增加使得越来越多的GDNA形成了G -四链体，使得体系的荧光强度增大，同时也说明槲皮素是一种能够诱导GDNA形成G -四链体的小分子配体。图5(B)表示不同浓度槲皮素与体系荧光强度变化的点线图及线性关系。结果显示槲皮素浓度在2～10 nmol/L时与体系荧光强度变化呈良好的线性，检出限0.7 nmol/L，线性方程[(F-F0)/F0]=0.0473c+0.0157(c的单位为nmol/L)，R=0.9972。

图5 (A)不同浓度槲皮素与GDNA/NMM体系作用荧光光谱;(B)槲皮素浓度与GDNA/NMM体系荧光强度变化的点线图和校准曲线Fig.5 (A) Fluorescence emission spectra of GDNA/NMM in presence of Quercetin with different concentration;(B)Point plots of change rate of fluorescence intensity GDNA/NMM with the increasing of Quercetin concentration and the calibration plots for QuercetinNMM:5 μmol/L;GDNA:1 μmol/L;Quercetin:b-f:0,2,4,6,8,10,100,200,1 000 nmol/L.

2.5 诱导GDNA形成G -四链体的小分子配体筛选

应用本方法考察了黄酮类化合物、生物碱、蒽醌类化合物和有机酸(表1)等小分子化合物，这些小分子化合物是从中药中提取出来的天然抗肿瘤药物小分子。通过考察加入药物前后NMM/GDNA体系荧光强度的变化来反映不同药物对体系的影响，从而来识别G -四链体的配体。表中ΔF=F-F0，其中F和F0分别表示不存在和存在药物的情况下NMM/GDNA体系的荧光强度。结果发现，在相同实验条件下黄酮类化合物都能使NMM/GDNA体系的荧光强度有一定程度的增加，而生物碱类、蒽醌类化合物(大黄素)及有机酸却变化不大。说明黄酮类化合物能促使GDNA形成G -四链体，而生物碱类、蒽醌类和有机酸等化合物难以诱导GDNA形成G -四链体结构。

表1 加入不同药物引起NMM/GDNA体系荧光强度变化

*The concentration of NMM,GDNA and ligands are 5 μmol/L,1 μmol/L and 2 μmol/L,respectively.

3 结论

本文以槲皮素为研究对象，荧光染料NMM为指示剂，利用其与G -四链体结构特异性结合的特点，构建了一种在均相溶液中筛选 G -四链体小分子配体的荧光新方法。研究发现黄酮类化合物能促使GDNA形成G -四链体，而生物碱类和有机酸等化合物难以诱导GDNA形成G -四链体结构。该方法不仅用于考察槲皮素与 GDNA 的作用，还可以用于筛选与 G -四链体作用的离子、蛋白质、合成的药物等小分子配体，对抗肿瘤药物的开发和研究，肿瘤的临床治疗等有重要的理论和实际意义。

参考文献：

[1] Blackburn E H,Szostak J W.Annual Review of Biochemistry,1984,53:163.

[2] Wag Y,Patl D J.Journal of Molecular Cell Biology,1993,4(234):1171.

[3] Ying L,Green J J,Li H,et al.Proceedings of the National Academy of Sciences,2003,100(25):14629.

[4] Guo L Q,Nie D D,Qiu C Y,et al.Biosensors and Bioelectronics,2012,1(35):123.

[5] Mei H Y,Barton J K.Journal of the American Chemical Society,1986,9(108):7414.

[6] Simonsson T,SjÖback R.Journal of Biological Chemistry,1999,24(274):17379.

[7] Balagurumoorthy P,Brahlnaehari S K,MohantyD,et al.Nucleic Acids Research,1992,15(20):4061.

[8] Redman James E.Methods,2007,4(43):302.

[9] Sun H X,Xiang J F,Tang Y L,et al.Biochemical and Biophysical Research Communications,2007,4(352):942.

[10] LIU P,CHEN F Y,XIONG Z D,et al.Journal of Analytical Science(刘萍,陈凤英,熊泽东,等.分析科学学报),2015,31(6):851

[11] Jin Y,Li H Y,Bai J Y,Analytical Chemistry,2009,81(14):5709.

[12] Sun H X,Tang Y L,Xiang J F,et al.Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,2006,13(16):3586.

[13] Sun H X,Xiang J F,Tang Y L,et al.Biochemical and Biophysical Research Communications,2007,4(352):942.

[14] Cushnie T P T,Lamb A J.Antimicrob Lamb,International Journal of Anti-Microbial Agents,2005,5(26):343.

[15] Spedding G,Ratty A,Middleton E.Antiviral Research,1989,2(12):99.

[16] Sayal A,Aydin A,Savaser A,et al.Toxicology Letters,2008,180:81.

[17] Guo L Q,Nie D N,Qiu C Y,et al.Biosensors and Bioelectronic,2011,1(35):123.

[18] Hu D,Huang Z Z,Pu F,et al.Chemistry A European Journal,2011,17(5):1635.

[19] Qin H,Ren J，Wang J,et al．Chemical Communications,2010，46(39):7385.

[20] Zhao C Q ,Wu L,Ren J S,et al.Chemical Communications,2011,47(19):5461.