离子迁移谱法快速筛查保健食品中非法添加降糖类药品

朱 俐, 冯 雪, 尹利辉*

(1.中国食品药品检定研究院，北京 100050;2.国家食品药品监督管理局药品评审中心，北京 10000)

降糖类保健食品拥有具大的市场，但为了追求功效在这类保健品中存在非法添加降糖类化学药品，而患者长期服用这类保健食品容易出现心慌、昏迷、肝肾功能损伤等危害[1]，因此，快速准确地辨别降糖类保健食品是否非法添加了西药成分直接关系患者的安全。目前，传统的分析检测方法有液相色谱法[2]、毛细管电泳法[3]、核磁共振法[4]、流动注射-化学发光分子印记法[5]等。这些方法不仅需要复杂的前处理而且分析时间较长。离子迁移谱(Ion Mobility Spectrometry,IMS)是20世纪60年代发展起来的一种新兴的分离检测技术，该技术是基于气相中不同的气相离子在电场中迁移速度的差异，对化学离子物质进行表征的一种分析方法。IMS法具有超快速、高灵敏的特点，并且仪器可开发为便携式，特别适用于快速筛查。目前已有报道用IMS法对抗疲劳类保健食品[6]、改善睡眠类保健食品[7]、化妆品中的抗生素[8]，环境中挥发性有机物[9]等进行检测，而对降糖类保健食品中非法添加化学药品的检测尚未见报道。

本文采用IMS法，比较全面和系统的研究了检测二甲双胍、盐酸苯乙双胍、甲苯磺丁脲、格列本脲、格列美脲、格列喹酮、格列吡嗪、格列齐特、盐酸罗格列酮、盐酸吡格列酮12种降糖药品的IMS条件，以及该方法的稳定性、精密度等，并将建立的方法应用于实际样品的检测，获得了良好的结果。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Excellims GA2100电喷雾离子迁移谱仪，Vision Analysis软件(版本2.2.2.10)；岛津LC-20AD高效液相色谱仪；梅特勒XS105DU电子天平；Millipore A10超纯水系统。

盐酸二甲双胍、盐酸苯乙双胍、甲苯磺丁脲、格列本脲、格列美脲、格列喹酮、格列吡嗪、格列齐特、盐酸罗格列酮、盐酸吡格列酮、瑞格列奈、那格列萘标准品，均购自中国食品药品检定研究院。Fisher色谱级甲醇，其他试剂为色谱纯。

保健食品样品由天津市药品检验所、深圳市药品检验所、湖北省食品药品监督检验研究院、安徽省食品药品检验所提供。

1.2 溶液制备

1.2.1标准溶液称取各标准品5.0 mg，分别置于25 mL容量瓶中，用甲醇-水(80∶20，甲酸调节pH=2)溶解并定容，配制成200 μg·mL-1的标准品储备液溶液，用时稀释至合适浓度(1～10 μg·mL-1)作为标准品溶液。

1.2.2样品溶液将样品(若样品为胶囊，则用内容物)研磨混匀后，称取50 mg，加入甲醇10 mL，超声10 min，静置后取其上清液过0.45 μm滤膜即为样品提取液；再用甲醇-水(80∶20，甲酸调节pH=2)分别稀释10、50、250倍，作为浓度梯度样品溶液。

2 结果与讨论

2.1 离子迁移谱条件的选择

本研究采用电喷雾离子迁移谱仪，其原理如图1。样品在去溶剂区离子化后，在电场的作用下，离子通过周期性开启的离子门，在大气压下进入弱电场漂移区，与逆流的中性漂移气体分子不断碰撞，由于这些离子在电场中各自迁移速率不同，使得不同的离子得到分离，先后到达检测器被检测，信号经放大后以离子迁移谱图形式输出[6]。从IMS的原理可知，IMS检测包含有两个关键过程：一是气相离子的形成；二是离子在迁移管中的迁移，气相离子的生成决定了离子迁移谱检测的第一步，只有形成足够的气相离子才可以被离子迁移谱仪检测到。IMS的离子源电压、迁移管电压、迁移管温度和迁移气流量对气相离子的形成和迁移均有较大影响，因此着重考察了这几个条件对降糖药品迁移时间和强度的影响。

图1 离子迁移谱原理图Fig.1 Schematic diagram of ion mobility spectrometry

图2 离子源电压强度的影响Fig.2 The influence of source voltage on intensity

图3 迁移管温度对迁移时间和强度的影响Fig.3 The influence of drift tube temperature on drift time and intensity

通过比较正源模式和负源模式，发现降糖药物在正源模式下信号较好，因此选用正源模式进行检测。众所周知，提高迁移管电压，会减少迁移时间，提高离子强度，离子源电压对迁移时间影响甚小，因此优化IMS条件，研究了离子源电压对降糖药品离子强度的影响(图2)，以及迁移管温度对12种降糖药品迁移时间和强度的影响(图3)。通过研究可知，离子源电压对离子强度有较大影响；而迁移管温度对12种降糖药品的迁移时间和强度均有较大影响，迁移管温度越高，离子迁移时间越短，迁移管电压越高，信号越强，而迁移管温度高于220 ℃时，峰形有所展宽，导致信号降低。综合考虑，选择离子源电压2.5 kV，迁移管电压7 000 V，迁移管温度180 ℃，该条件下各降糖类药品峰形尖锐，灵敏度也较高。

2.2 溶剂的选择

由于该仪器的灵敏度非常高，因此实际应用中微量杂质也有可能有信号，影响结果判断。因此如果提高目标物的灵敏度，提高其信号强度，可避免误判。在研究过程中发现溶剂采用甲醇-水(80∶20,V/V)，并用甲酸调节到pH为2时，目标物的信号显著增强，其他杂质信号并没有明显增强。分析原因可能是这几种降糖药物的结构含有可接受质子的基团，酸性条件下比较容易形成[M+H]+离子峰，而采用甲醇-水(80∶20)可以使溶剂粘度下降、溶液表面能较低，导致溶剂迅速蒸发，更易达到库仑分裂条件，产生更小的子雾滴，有利于雾化，使得待测物信号增强。

图4 色氨酸校正考察Fig.4 The drift time measured after calibration by trptophan

2.3 离子迁移谱的校正

IMS分析中，离子迁移时间是定性的关键因素。由于仪器出厂时正源模式都采用校正物质色氨酸进行检测，故采用色氨酸的迁移时间10.210 ms作为校正时间，将测试条件都校准至出厂时的条件，得到出厂条件下各被测物的迁移时间，不仅可以实现ESI-IMS各仪器之间测得迁移时间的直接比较，而且还可以保证每次测试的各物质的迁移时间的稳定性。通过对校正物质迁移时间的考察，我们发现在3 h以内仪器校正稳定性良好，偏差不超过0.005 ms。图4是色氨酸迁移时间的考察曲线，从图中可知为了确保校正的可靠性，建议仪器应每2 h用色氨酸进行一次校正。

2.4 迁移时间及检出限

取12种降糖药物标准储备液逐级稀释，样品溶液浓度由低到高进入IMS仪进行分析，各浓度平行采集6次，并分别在4～8月份进行试验，考察每种药品的迁移时间范围，计算标准条件下的约化迁移率(K0)，并建立12种降糖药品的IMS数据库。以信噪比(S/N)为3时的检出浓度作为检出限(LOD)，具体结果见表1。

表1 降糖类药物对照品IMS特性

研究发现，双胍类药物的IMS响应很强，灵敏度很高，检测限可达ng·mL-1级，这与双胍类药物中含有碱性极强的胍基，易于质子化有关，噻唑烷酮类药物也是以盐酸盐形式存在，响应也较好；磺酰脲类药物测限较高，响应较低，10 μg·mL-1格列本脲、格列吡嗪、格列喹酮响应分别仅有约0.2、0.3、0.25 V，这与磺酰脲基团里的N原子的孤对电子与磺酰基形成共轭体系，电子向双键转移，给电子趋势减弱，进而使得其加合质子能力降低有关；而格列齐特结构中磺酰脲基的N原子与一叔N原子连接，有利于其质子化，响应相比较格列本脲、格列吡嗪、格列喹酮有所增强。

2.5 稳定性考察

稳定性实验是在4个月内，每个月随机选取5 d对各物质的标准溶液进行IMS分析，每次每种标准溶液平行采集6针，观察4个月内迁移时间的稳定性。12种降糖药物在 4 个月内任意5 d的迁移时间的标准偏差均在0.05 ms以内，且迁移时间的RSD均在 0.5% 以内，稳定性良好。说明以迁移时间为定性指标建立非法添加物IMS标准谱库的可行性。在实际样品的分析中可直接利用该谱库进行非法添加物的初步筛查，检测方便快速，而不必使用标准品进行对照，更加适用于现场快速筛查。

2.6 样品分析

图5 辅助降血糖类空白对照样品IMS图Fig.5 IMS of blank sample without hypoglycemic drugs

2.6.1样品基质干扰考察选取用液相色谱法未检出降糖药品的样品来考察基质干扰情况，离子迁移谱图如图5，发现在降糖药物出峰的位置均无干扰峰出现。

2.6.2实际样品测定迁移管有较强的记忆效应，如果进样浓度很高，其记忆效应很难清洗干净。由于样品中非法添加药品的含量未知，因此把样品稀释不同倍数，从低浓度采集数据，这样不仅减小记忆效应，还能有效保证检测结果准确。样品10的典型IMS图和液相色谱如图6所示。通过对实际样品分析，并将IMS法检测结果与液相色谱法[10]检测结果对比，发现IMS法对阴性样品及阳性样品的判别正确率为100%，结果见表2。

从12种降糖药物的离子迁移时间来看，有些药物的迁移时间非常接近并且波动范围有重叠现象，如图7所示。这种现象给最终作为定性判断带来困扰。但根据我们检测各种样品的得到的结果表明，保健食品非法添加化学药品一般都是单品种添加或者至多两种药品添加；在实际样品在检测时，如果在B、C位置有峰，即可判断该样品非法添加的了化学药品，完全可以达到快速筛查的目的。

图6 样品10的IMS谱图(a)和液相色谱图(b)Fig.6 IMS spectrum(a) and liquid chromatogram(b) of sample 10

图7 药品迁移时间重叠情况下结果判断示意图(A、B、C、D、E、F、G表示检出未知物)Fig.7 Diagram of judgment from overlap of drugs drift time(A,B,C,D,E,F,G refer to detected drugs)表2 16种降血糖类保健食品IMS检测结果Table 2 Measured drift times and ion mobilities of extracts from 16 dietary supplements fordiabetes mellitus,and identification of adulterants

SampleNo.DilutionmultipleDrifttime/msK0/(cm2·V-1·s-1)Detecteddrug1250×10.0108±0.00211.4686±0.0003Phenforminhydrochloride50×10.0102±0.00191.4687±0.00032250×10.0047±0.00051.4696±0.0001Phenforminhydrochloride50×10.0074±0.00051.4692±0.00013250×10.0047±0.00081.4696±0.0001Phenforminhydrochloride50×10.0054±0.00171.4694±0.00034250×7.9603±0.00241.8470±0.0006Metforminhydrochloride50×7.8988±0.00221.8614±0.00055250×7.9613±0.00081.8467±0.0002Metforminhydrochloride10.0074±0.00121.4692±0.0002Phenforminhydrochloride50×7.9595±0.00101.8472±0.000210.0092±0.00141.4688±0.00026aNone7aNone8bNone9250×7.9633±0.00101.8463±0.0002Metforminhydrochloride10.0032±0.00061.4698±0.0001Phenforminhydrochloride50×7.9595±0.00221.8472±0.0005Rosiglitazone10.0048±0.00191.4696±0.000312.6966±0.00241.1580±0.000210250×10.0100±0.00131.4688±0.0002Phenforminhydrochloride50×10.0100±0.00181.4688±0.000311250×7.9552±0.00161.8481±0.0004Metforminhydrochloride13.0480±0.00411.1269±0.0004Pioglitazone50×8.0146±0.01971.8345±0.004513.0402±0.00531.1273±0.000512250×7.9633±0.00051.8463±0.0001Metforminhydrochloride10.0084±0.00051.4690±0.0001Phenforminhydrochloride50×7.9583±0.00081.8474±0.000210.0060±0.00191.4693±0.000313250×10.0083±0.00081.4690±0.0001Phenforminhydrochloride50×10.0090±0.00061.4689±0.000114aNone15250×12.7148±0.00131.1563±0.0001Pioglitazone50×12.7150±0.00151.1563±0.000116250×7.9687±0.00041.8450±0.0009Metforminhydrochloride50×7.9712±0.00131.8444±0.0003

Note:a.soft capsules;b.pill;the others are capsules.

3 结论

建立了12种降糖药品迁移时间数据库，我们在另一台不同地点(东营)相同型号的仪器进行12种降糖药物的迁移时间验证，验证结果12种降糖药物的迁移时间均在本方法的迁移时间范围内，因此建立12种降糖药物IMS迁移时间数据库，可以在不同仪器间实现数据库的共享。本方法操作简单，不需要标准物质，通过所建立的数据库比对即可进行快速筛查，分析速度极快(1 min)，筛查准确率高(100%)，因此可考虑建立其他类保健食品非法添加药品IMS迁移时间数据库，应用于实际检测，减低检测成本，提高效率，保证保健食品的质量安全。

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