Fe2O3@Au双模态纳米粒子在生物成像中的应用

夏 青， 陆美林， 张晓丽， 章俊平， 于源华,， 何秀霞*,

(1.长春理工大学生命科学技术学院，吉林长春 130022，2.长春理工大学环境与工程学院，吉林长春 130022)

目前，结构纳米材料在生物医学领域引起了广泛关注，包括超灵敏探测、生物医学成像、靶向治疗等[1]。尤其是在分子成像领域，如核磁共振成像(MRI)[2 - 3]、正电子发射断层成像(PET)[3]、电子计算机X射线断层扫描(CT)[4 - 5]、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)[6 - 7]、光学成像[8]等进行肿瘤体内外成像诊断。为了提高疾病诊断的准确度，理想的方法是将多种成像模式集于一种纳米材料中。

Fe2O3@Au纳米粒子中的Fe2O3具有超顺磁性，可在MRI中作为T2测量的造影剂[9 - 10]。而Au纳米粒子作为一种新的CT造影剂可用于肿瘤成像[11]，其与传统的含碘造影剂相比有更高的X射线吸收系数、易于表面修饰、良好的生物兼容性和较长的循环时间，可以在较长时间内进行成像。已有研究小组制备了Fe2O3@Au应用于生物系统的双模态MRI/CT成像[12 - 13]。但是纳米粒子的粒径、形状、表面活性等影响了它在生物体中的应用[14 - 15]。20～50 nm 粒径大小的纳米粒子表现出最有效的吸收动力学特性，这可能是细胞吸收纳米粒子最有效的尺寸，同时球形纳米粒子要比其它形状的纳米粒子更易被吸收[16 - 17]。本文制备了26 nm球形Fe2O3@Au纳米粒子，具有低毒、高X射线吸收系数、高流通性和稳定性。通过荷瘤裸鼠的活体成像实验，证明了小粒径的Fe2O3@Au具有更强的体内成像能力。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

3.0T超导型磁共振扫描仪 (Signa HDx)，5.0 cm 小动物实验专用线圈，GE64排螺旋CT系统均为美国GE公司；Urmini-1240紫外-可见分光光度计(日本，岛津公司)；H-600型透射电子显微镜(TEM)(日本，日立公司)；JSM6490LA能谱仪(EDS)(日本，电子公司)。

3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)、二甲亚砜(DMSO)等，购自北京鼎国生物有限公司。其它化学试剂均为分析纯。所有实验用水均为Milli-Q超纯水(18.2 MΩ·cm)。

细胞培养基DMEM和胎牛血清(FBS)均购自美国Gibco公司。SW620人结直肠癌细胞株购自中科院上海细胞库。BALB/c裸鼠(雄性，4～5周龄，20 g左右)购自中科院上海实验动物中心，饲养于清洁级环境(吉林大学实验动物中心)，使用裸鼠专用饲料和无菌水饲养。

1.2 实验方法

1.2.1Fe2O3@Au核壳纳米粒子的合成改进Lyon等人所报道的方法[18]，通过共沉淀法制备Fe3O4纳米粒子[19]。将100 mL 0.01 mol/L HCl加入Fe3O4纳米粒子溶液中，得到的胶体用磁铁收集并用水冲洗两次。新制备的Fe3O4纳米粒子用0.01 mol/L HNO3溶解，在90～100 ℃水浴中剧烈搅拌6～8 h，直至完全形成Fe2O3后，冷却至室温并用水冲洗两次，用0.1 mol/L的TMAOH冲洗一次。所获得的Fe2O3纳米粒子分散在0.1 mol/L的TMAOH中，静置直至液体澄清为酒红色。将Fe2O3胶体用30 mL水稀释到1.1 mmol/L，加入1.5 mL 0.1 mol/L柠檬酸钠，剧烈搅拌10 min后，参考Lyon等人的方法将一定量的0.2 mol/L盐酸羟胺和1%HAuCl4，间隔10 min先后添加到上述溶液中，直至获得所需Fe2O3@Au纳米粒子。

1.2.2Fe2O3@Au纳米粒子的表征及PEG-SH5000的修饰使用紫外-可见分光光度计对Fe2O3@Au纳米粒子制备过程进行监控。将Fe2O3@Au纳米粒子利用能谱仪(EDS)进行元素组成分析。利用透射电子显微镜(TEM)在100 kV加速电压下测量纳米粒子粒径、形貌变化及粒子的分散情况。并由Image J软件统计200个纳米粒子的粒径。将Fe2O3@Au纳米粒子分别与PEG -SH5000 以不同摩尔比(1∶2 500，1∶5 000，1∶10 000，1∶25 000，1∶50 000 和1∶80 000)反应1 h，通过离心除去未反应配体(4 000 r/min，30 min，3次)，分散于水中，4 ℃下保存备用，命名为PEG -Fe2O3@Au。将其分别分散在不同的缓冲体系中：水、0.4 mmol/L柠檬酸钠、200 mmol/L NaCl、10 mmol/L HEPES、10 mmol/L PBS、10 mmol/L PBS +10%FBS、100%FBS、DMEM+10%FBS。37 ℃放置7 d，肉眼观察并进行紫外-可见光谱的测量。考察PEG -Fe2O3@Au在各种缓冲液中的稳定性。

1.2.3细胞毒性实验以1.0×104cells/mL的密度将 SW620细胞接种于96-孔板中，过夜孵育细胞后，更换含有不同浓度PEG -Fe2O3@Au(0.06、0.12、0.24、0.48、0.72 nmol/L)的培养基继续培养。24 h之后去掉含纳米粒子的培养基，在新鲜培养基中添加10 μL MTT(5 mg/mL)[20]。先用酶标仪的全波长扫描测出吸收峰，将该吸收峰所在的波长作为测量波长。用微型孔板分光光度计读出510 nm处的吸光度值，以未与Fe2O3@Au共培养的SW620细胞为对照组。相对的细胞活率为[A]test/[A]control×100%。每组实验重复3次。

1.2.4试管的MRI/CT成像将不同Fe浓度(0.06、0.12、0.18、0.24、0.36、0.48、0.6、0.72 mmol/L)的Fe2O3@Au及PEG -Fe2O3@Au的PBS溶液各1 mL，分别置于1.5 mL离心管中，用MFSE序列进行T2驰豫时间的测量。参数如下：TR=2 500,TE=13～104 ms,flip angle=90°,resolution=256×256,section thickness=3 mm,FOV=16×16 mm。T2驰豫效率由1/T2与纳米粒子的Fe浓度的函数关系得到的线性关系的斜率决定。T2mapping是由3.0 T超导型磁共振扫描仪执行完成。不同Au浓度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.5 mg/mL)CT成像是由64排CT成像系统完成。成像参数如下：100 kV，80 mA，silce thickness=0.625 mm。测定每个样品的Hounsfield units(HU)值。

1.2.5荷瘤裸鼠模型的建立及体内的MRI/CT成像将结直肠癌细胞SW620以1.0×107cells/mL用DMEM培养基重悬，以200 μL/只用量对4～6周龄的BALB/c裸鼠(约20 g)进行右腋皮下接种，接种2周后待肿瘤直径达到3～5 mm左右进行成像分析。先将0.25 mL(52 nmol/L Fe2O3@Au，其中Au和Fe分别为 5.93、1.7 mg/mL)的Fe2O3@Au的PBS溶液经裸鼠的肿瘤区域皮下注射到体内，分别在注射前和注射30 min后进行CT和T2 MRI成像分析。CT成像参数同前，MRI参数如下：TR：4 000 ms，TE：17.5 ms，FOV：12.0×12.0，DFOV：8.0 cm，288×256，1.0 mm。以同样直径的目标区域(the region of interest(ROI))放置在注射及未注射造影剂T2-成像的同一片层，得到肿瘤的信号强度。

2 结果与讨论

2.1 纳米粒子的表征

合成过程中所获得的Fe2O3纳米粒子分散在0.1 mol/L TMAOH中，必须静置直至液体澄清为酒红色才可以使用，经过静置会获得平均粒径3.90±1.39 nm均匀的纳米粒子胶体溶液，伴随盐酸羟胺和1%HAuCl4的加入，溶液颜色由淡黄色逐渐变成类似纯金纳米粒子的深红色(图1插图)。要比Lyon在最终合成的呈深粉红色Fe2O3@Au纳米粒子溶液更接近纯Au纳米粒子的颜色，表明纳米粒子粒径更小而且表面包被了更多的Au，便于后续利用Au的特性进行CT成像。如图1所示，SPR峰值逐渐增加并蓝移至521 nm。说明Au在纳米粒子中的量增加。EDS谱图表明了Fe和Au同时存在(图2)。由电感耦合等离子体发射光谱定量分析可知Au∶Fe2O3的摩尔比约为1.07∶1。

图1 Fe2O3@Au纳米粒子的紫外-可见(UV-Vis)光谱图(插图为合成纳米粒子溶液颜色的变化)Fig.1 UV-Vis spectra of Fe2O3@Au nanoparticles(The inset shows a color change of the nanoparticle dispersiov solution)

图2 Fe2O3@Au纳米粒子的能谱(EDS)图Fig.2 EDS spectra of Fe2O3@Au nanoparticles

由透射电镜(TEM)表征结果可知：Fe2O3的平均粒径是3.90±1.39 nm (图3A)，Fe2O3@Au的平均粒径值变为26.22±4.14 nm(图3B)，且证实了纳米粒子近似球状并具有较窄的粒径分布。

图3 Fe2O3(A)和Fe2O3@Au(B)纳米粒子的透射电镜(TEM)图(插图表示纳米粒子的粒径分布柱状图)Fig.3 TEM images of Fe2O3(A) and Fe2O3@Au(B)(The inset shows the histogram of the size distribution the nanoparticles)

观察PEG -Fe2O3@Au纳米粒子在各种介质中，于37 ℃下放置7 d之后没有明显的沉淀，在水中和0.4 mmol/L 柠檬酸钠中的紫外-可见光谱几乎没有发生变化。在其它缓冲溶液中随着时间的延长，纳米粒子在离心管管壁上发生吸附使紫外-可见光谱的吸收峰下降。但纳米粒子的SPR峰值未发生明显移动，说明其未发生变性。表明PEG -Fe2O3@Au在各种生理环境条件下具有更好的胶体稳定性。

2.2 细胞毒性试验

以510 nm为测量波长，用微型孔板分光光度计读出510 nm处的吸光度值。MTT分析SW620与高达0.7 nmol/L PEG -Fe2O3@Au纳米粒子作用24 h之后，发现随着纳米粒子浓度的增加，相对细胞活率反而高于对照组，类似于Xie和Chien等人的研究结果[21 - 22]。表明PEG -Fe2O3@Au不影响细胞新陈代谢且有很好的生物兼容性(图4)。

图4 MTT检测PEG -Fe2O3@Au 纳米粒子与细胞作用24小时后的细胞毒性Fig.4 The cell survival rate of SW620 human colorectal cancer cells after mixed with different concentrations of PEG -Fe2O3@Au for 24 h by MTT assay.

2.3 试管的MRI/CT成像

通过3.0 T核磁成像仪对不同浓度Fe2O3@Au纳米粒子溶液T2值进行测量，结果表明Fe2O3@Au纳米粒子的驰豫效率为83.75 L/(mmol·s)，而PEG -SH修饰的Fe2O3@Au纳米粒子的驰豫效率则减少到56.12 L/(mmol·s)，这是由于纳米粒子表面PEG -SH层屏蔽了水分子与纳米粒子表面的接近，从而引起了r2驰豫效率的降低(图5)。图6插图为不同浓度纳米粒子的T2核磁成像，PBS为对照，随着Fe浓度的增加，成像信号明显变暗。

同样CT成像证实Fe2O3@Au纳米粒子的X射线吸收强度随着纳米粒子浓度的增加而增加。当纳米粒子中的Au浓度为4.2 mg/mL 的Hounsfield Unit值为200 HU，等同于目前临床通用的基于碘的小分子的CT造影剂8 mg/mL Omnipaque的造影效果，X射线吸收系数是碘的1.93倍(比碘高93%)，高于张松等人[23]的1.87倍，显示了其更优越的成像性能(图6)。

图5 PEG -Fe2O3@Au和Fe2O3@Au的T2驰豫效率(1/T2)(插图为PEG -Fe2O3@Au和Fe2O3@Au纳米粒子的T2-wMR成像)Fig.5 T2 relaxed efficiency(1/T2) of PEG -Fe2O3@Au and Fe2O3@Au nanoparticles(The inset shows T2-wMR images of PEG -Fe2O3@Au and Fe2O3@Au nanoparticles)

图6 在100 kVp条件下不同浓度PEG -Fe2O3@Au 纳米粒子的HU值(插图为相应的CT成像)Fig.6 HU values of various concentrations of PEG-Fe2O3@Au nanoparticles at 100 kVp(The inset shows CT images of PEG -Fe2O3@Au nanoparticles)

2.4 纳米粒子体内成像分析

将溶于250 μL NaCl 溶液的52 nmol/L Fe2O3@Au纳米粒子，皮下注射到裸鼠腋下肿瘤部位(用红色圈标出)。发现纳米粒子注射后30 min仍然保留。CT测量的HU值从40(图7a)增加到700(图7b)。MRI成像中，肿瘤区域在注射纳米粒子前值为1 015(图7(c))，而注射纳米粒子30 min后值为1 904(图7(d))，肿瘤区域明显变暗。

图7 对荷瘤裸鼠进行CT(a和b)成像和T2 MRI(c和d)成像及未注射(a和c)和注射Fe2O3@Au纳米粒子30 min后(b和d)的成像Fig.7 CT(a and b)and T2 MRI(c and d)images of the nude mice bearing a tumor pre-injection without intratumoral injection of Fe2O3@Au nanoparticles(a and c) and with intratumoral injection of Fe2O3@Au nanoparticles after 30 min

3 结论

本文结合Fe3O4的超顺磁性及Au纳米粒子的X射线吸收特性，制备了小粒径且具有良好生物相容性的Fe2O3@Au纳米粒子，实现了荷瘤裸鼠的活体MRI/CT双模态成像，并有望将Fe2O3@Au进一步作为靶向探针应用于活体双模态成像。

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