适用于黄酒米浆水处理的酵母菌的筛选

孙士勇 ， 曹 钰 *，2， 陆 健 ，， 蔡国林 ， 马素梅

（1.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡214122；3.江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡 214122）

米浆水是黄酒酿造过程中浸米工序的副产物，传统黄酒酿造，浸米时间比较长，比如传统的摊饭法酿酒时，浸米时间就长达16～20 d。现在机械化黄酒生产工艺中一般采用较高的温度保温浸米，浸米的时间减少，但是仍需要4～5 d[1]。程斐等使用生物酸化浸米的方法，人工接种乳酸菌进行浸米，快速提高米浆水的酸度，将浸米时间缩短为2 d[2-3]。米浆水中含有十分丰富的淀粉、蛋白质、糖类、有机酸等，其中氨基酸的种类多达18种，还有微量元素、B族维生素和矿物质等[4]。米浆水产量非常巨大，生产1 t黄酒大约要产生0.65 t米浆水。2014年我国黄酒产量达到330万t左右，按照测算总共产生约214.5万t米浆水。采用厌氧-好氧方式处理米浆水，每吨大约花费2元以上，加上设备购置和维护费用，米浆水的处理带来了很大的负担，同时也是对营养物质的浪费。

目前对米浆水的资源化利用还比较局限，俞关松等[5]把新鲜的米浆水作为复制糟香型白酒的投料用水，但受到酿造季节的约束，有一定的局限性。周高峰等[6]添加75%的米浆水来代替自来水制作黄酒熟麦曲。姜佳丽等[7]考察了用米浆水来替代制曲配料用水制备酱油生产用米曲霉、黑曲霉和红曲霉的制曲效果。但作为制曲用水，整体消耗量较小。

类胡萝卜素是一类广泛存在于动植物和微生物体内的脂溶性色素，已被用于药物、保健食品、饲料和化妆品的生产中[8-12]。类胡萝卜素对动物和人体具有十分重要的作用，不仅可以作为维生素A的前体[13]，同时还具有很强的抗氧化性，能清除体内的自由基[14]，动物和人体内的类胡萝卜素只能从外界获取[15-16]。可以产生类胡萝卜素的酵母主要有红酵母属（Rhodotorula），锁掷酵母属（Sporidiobolus），法夫酵母属（Phaffia），掷孢酵母属（Sporobolomyces）和红冬孢酵母属（Rhodosporidium）[17-21]。采用酵母生产类胡萝卜素具有营养要求简单、发酵周期短和发酵条件易于控制等优点[22]。

作者在环境中分离筛选了一株近玫色锁掷酵母，一方面可以利用米浆水中的营养物质，降低米浆水的COD，大大减轻废水处理压力，另一方面也可以生产单细胞蛋白（SCP）和类胡萝卜素，提高了经济效益。

1 材料与方法

1.1 培养基

YPD培养基：蛋白胨20 g/dL，酵母膏10 g/dL，葡萄糖20 g/dL，pH自然；

富集培养基：蛋白胨20 g/dL，酵母膏10 g/dL，葡萄糖20 g/dL，链霉素0.005 g/dL，pH自然；

酸性YPD培养基：蛋白胨20 g/dL，酵母膏10 g/dL，葡萄糖20 g/dL，调pH至 3.5；

淀粉培养基：（NH4）2SO40.5 g/dL，KH2PO40.1 g/dL，NaCl 0.01 g/dL，MgSO4·7H2O 0.05 g/dL，CaCl20.01 g/dL，酵母膏 0.02 g/dL，淀粉 2 g/dL，pH6.5；

乳酸培养基：（NH4）2SO40.5 g/dL，KH2PO40.1 g/dL，NaCl 0.01 g/dL，MgSO4·7H2O 0.05 g/dL，CaCl20.01 g/dL，酵母膏 0.02 g/dL，用乳酸调 pH 至 3.5～3.7；

MRS培养基：葡萄糖2 g/dL，蛋白胨1 g/dL，乙酸钠0.5 g/dL，牛肉膏1 g/dL，柠檬酸氢二铵0.2 g/dL，酵母膏 0.5 g/dL，MgSO4·7H2O 0.058 g/dL，吐温80 0.1 g/dL，MnSO4·4H2O 0.025 g/dL，K2HPO40.2 g/dL，pH 6.2～6.4。

1.2 生物酸化浸米浆水（BAS）的制备及成分分析

称取一定质量糯米，按1∶1.25的米水比加水，接种植物乳杆菌进行生物酸化浸米，30℃浸渍2 d后，过滤得到生物酸化浸米浆水（BAS，Bio-acidified Seriflux）。测定米浆水的pH、总酸、总糖、淀粉、蛋白质、氨基酸态氮、氨态氮和COD。

1.3 菌株的分离

1.3.1 一级筛选 在学校及附近生活区采集水样、土样、花草、食品样本，于富集培养基中富集过夜，涂布于YPD固体培养基，30℃培养2 d，挑取红色菌落，镜检观察是否为酵母菌。

1.3.2 二级筛选 将第一步筛选到的产色素酵母菌株接种到酸性YPD培养基中，30℃、200r/min振荡培养72 h，测定培养后的pH、生物量、色素产量，同时将菌液离心后用无菌水洗涤两次，用等体积无菌水重悬，30℃放置2 h进行饥饿处理，滴加在乳酸平板和淀粉平板上，30℃培养72 h，观察菌株对乳酸和淀粉的利用情况，综合考虑，筛选出性能较优的菌株。

1.3.3 三级筛选 将上一步筛选的酵母菌株接种到YPD培养基过夜作为种子液，将菌液离心后用无菌水洗涤两次，用等体积无菌水重悬，以5%的接种体积分数接种于BAS（装液量20%）中，30℃，200r/min培养48 h，测定pH、细胞数、色素产量、COD去除率，选择综合性能最优的菌株。

1.4 菌株R-70的形态特征

显微形态：挑取酵母菌培养液稀释一定倍数，吸取一滴在洁净的载玻片上，盖上盖玻片，用高倍镜观察细胞的形状、大小和生殖方式。

菌落形态：将新鲜培养的酵母菌在YPD平板上划线，30℃培养3 d，观察菌落的颜色、质地、表面和边缘形状等特征。

1.5 菌株R-70的生理学特征

对酵母菌进行糖发酵、碳源同化、氮源同化、脲酶试验和生长温度试验，方法参照《酵母菌的特征与鉴定手册》[23]。

1.6 菌株R-70的分子生物学鉴定

使用酵母基因组DNA快速抽提试剂盒提取酵母的总DNA， 使用通用引物NL-1 （5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL-4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'） 对菌株 26S rDNA近5'端的D1/D2区域进行PCR扩增，目标产物的长度大约为600 bp，PCR反应条件为：94℃变性 1 min，53℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，36个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，回收后纯化，由上海生物工程有限公司进行序列测定，根据测序结果，在NCBI上用BLASTN对扩增序列进行同源性比较，用MEGA5.0软件中的Neighbor-Joining分析方法进行分子系统分析，构建系统发育树，并进行1 000次的Bootstraps检验。

1.7 菌株R-70在BAS中的生长情况

将筛选的红酵母接种到经过60℃处理30 min的BAS中，30℃、200r/min振荡培养72 h，每隔4小时取样，血球计数板法测定细胞数，R-70菌株的色素为胞内色素，使用酸热法破壁后用丙酮提取色素并测定[24]，离心后烘箱法[25]测定上清液的COD。

1.8 BAS中接种菌株R-70培养后的成分变化

将筛选的红酵母接种到经过60℃处理30 min的BAS中，30℃、200r/min振荡培养72 h，每隔4小时取样，测定培养液的pH，靛酚蓝-分光光度法[26]测定氨态氮质量浓度，测定培养液的还原糖和氨基酸态氮，测定方法参考国标GB/T 13662-2008。

2 结果与讨论

2.1 生物酸化浸米浆水（BAS）的成分分析

自然浸渍的米浆水受到米种类、产地来源、水温等多种因素影响，其组成和COD存在差异和波动显著现象。为保障研究工作的开展，作者采用生物酸化浸米浆水进行实验。称取一定质量糯米，按1∶1.25的米水比加水，接种植物乳杆菌进行生物酸化浸米，30℃放置2 d后，过滤得到BAS，测定成分，结果见表1。

表1 BAS的成分分析Table 1 Component analysis of Bio-acidified Seriflux

由表1可以看出，米浆水营养丰富，经过生物酸化浸米的米浆水，成分比较稳定，有利于后期发酵过程的稳定性。生物酸化浸米得到的米浆水，pH较低，含有一定的淀粉和有机酸，其中有机酸主要为乳酸，约占88.98%，在后期的筛菌过程中，除生长情况和COD降解率外，也考察菌株对淀粉和乳酸的利用情况。

2.2 菌株的筛选

在环境中分离筛选到108株红色酵母菌株，测定菌株的生物量、色素产量和色素质量分数，并且考察了各菌株对淀粉和乳酸的利用能力，部分筛选结果见表2。

表2 二级筛选的部分结果Table 2 Part of results of secondary screening

R-30可以以乳酸为惟一碳源，R-46、R-50、R-70和R-85菌株的产色素能力较强，选择这5株相对较优的酵母菌株进入下一步筛选。

分别接种到YPD液体培养基中，振荡培养24 h，用无菌水洗涤2次，制备种子液。以5%的接种体积分数接种于BAS中，30℃、200r/min振荡培养48 h，分别测定培养前后的米浆水各个指标，结果见表3。

R-70菌株对米浆水COD的降解率最高，达到90.38%，色素产量也是最高，达到5.57 mg/L，处理后的发酵液pH相较于其他四株酵母都要低，为8.41。此外，R-30菌株可以以乳酸为惟一碳源生长，但是其他特性相对较差。综合考虑，选择R-70菌株作为利用米浆水的最优菌株。

表3 菌株在BAS中的培养筛选结果Table 3 Results of strain inoculated in BAS

2.3 菌株的形态特征

R-70菌株菌落呈橘红色，表面湿润，边缘平滑，易挑起。菌体呈椭球形，大小约为（3.0～4.5）μm×（6.0～9.5） μm，以出芽方式进行繁殖，见图 1。

图1 R-70菌株的形态特征Fig.1 Morphological character of R-70

2.4 序列分析和系统发育树的构建

以通用引物进行PCR扩增，经1 g/dL琼脂糖凝胶电泳，得到片段长度大约为600 bp的扩增产物，见图2。

图2 菌株R-70的26S rDNA的PCR产物电泳图Fig.2 Electrophoresis of PCR products of 26S rRNA of R-70

回收并纯化PCR产物，进行测序。将测得的DNA序列在NCBI上用BLASTN进行同源性比较，用MEGA5.0软件中的Neighbor-Joining分析方法进行分子系统分析，构建系统发育树构建系统发育树，结果见图3。

图3 R-70的系统发育进化树Fig.3 Phylogenetic tree of strain R-70

结果表明，菌株R-70与Sporidiobolus pararoseusNL8208205的同源性达到97%，亲缘关系最近，由此可初步确定R-70菌株为Sporidiobolus pararoseus（近玫色锁掷酵母）。

2.5 菌株的的生理学特征

2.5.1 糖发酵实验 参考《酵母菌的特征与鉴定手册》，对R-70进行了糖的发酵实验，结果见表4。R-70菌株对这几种糖都不发酵产气。

表4 R-70的糖发酵实验Table 4 Sugar fermentation tests of R-70

2.5.2 碳氮源同化实验及其他生理特征 对R-70菌株进行碳源、氮源同化实验，脲酶试验和生长温度试验，结果见表5。

表5 R-70的生理生化特征Table 5 Physiological characteristic of R-70

通过比对 《酵母菌的特征与鉴定手册》，菌株R-70的生理特征鉴定结果为近玫色锁掷酵母，与经26S rDNA分子鉴定的结果一致。

2.6 R-70菌株在BAS中的生长情况

将近玫色锁掷酵母R-70接种到YPD培养基中，30℃、200r/min培养过夜，作为种子液，用无菌水洗涤两次，以6%的接种体积分数接种到经过60℃处理30 min的BAS中，30℃、200r/min振荡培养72 h，每隔4小时取样，测定细胞数、色素产量、pH，结果见图4。

图4 R-70在米浆水中的生长情况Fig.4 Growth curves of R-70 inoculated in BAS

由图4可以看出，酵母数在36 h达到最大，为7.8×107/mL，之后呈缓慢下降趋势，R-70所产色素主要是类胡萝卜素，属于次级代谢产物，36 h开始有一个较快的增加速度，在44 h达到一个较高值5.26 mg/L，之后缓慢增加，72 h的色素产量为5.92 mg/L。米浆水的初始pH为3.68，随着培养时间的增加，米浆水的pH呈上升趋势，在28 h左右pH升高速度加快，在44 h左右之后趋于平缓，升高速度变慢，72 h的pH达到8.44，可能与R-70产脲酶有关，R-70在生长过程中产氨，使pH升高。

2.7 米浆水成分的变化

将R-70菌株接种YPD培养基中，30℃、200r/min培养过夜，作为种子液，用无菌水洗涤两次，以6%的接种体积分数接种到经过60℃处理30 min的BAS中，30℃、200r/min振荡培养72 h，每隔4小时取样，8 000 r/min离心5 min，测定上清液中的COD、还原糖和氨态氮，结果见图5。

BAS的初始COD为51 806 mg/L，接种R-70培养后上清液的COD变化见图5。到44 h达到最低，COD为4 600 mg/L，COD去除率达到91.12%，之后呈升高趋势。还原糖呈现下降趋势，40 h下降到一个较低值，之后基本保持不变。上清液中氨态氮质量浓度的变化与R-70菌株产脲酶有关，在前期质量浓度较低，随着培养时间的延长而缓慢增加，40 h左右之后增加速度加快，72 h的氨态氮质量浓度为1.45 g/L，R-70在发酵过程中产氨的量可以将米浆水中的乳酸中和并且氨过量，使发酵液呈碱性。

图5 BAS发酵后上清液成分的变化情况Fig.5 Change of composition in BAS supernatant

3 结 语

黄酒生产中的浸米浆水产量大，营养物质丰富。从环境中筛选到一株红色酵母R-70，经过26S rDNA分子鉴定，确定该酵母为近玫色锁掷酵母，在米浆水中培养，可以有效地降解米浆水的COD，减轻废水处理的压力，而且可以产生高附加值的单细胞蛋白和类胡萝卜素，具有良好的应用价值。

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