解毒药与凉血药配伍对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型的干预作用

翟春艳 底婷婷 赵京霞 王 燕 解欣然 李 雪,3 蒙玉娇,3 李宁飞,3刘正荣,3 张 璐 张 蕾 王 宁 李 萍*

(1.首都医科大学附属北京中医医院，北京100010; 2. 北京中医医院北京市中医研究所 银屑病中医临床基础研究北京市重点实验室，北京100010; 3.北京中医药大学 北京中医医院，北京100027)

银屑病是一种常见的以鳞屑、浸润、红斑为主要临床表现的慢性炎性反应性皮肤病。中医称之为“白疕”，认为“内有蕴热、郁于血分”是其基本病机，主张“从血论治”[1]，治法主要为“清热凉血”，代表方剂为凉血汤。首都医科大学附属北京中医医院及北京市中医研究所在此基础上提出“血分蕴毒”的理论，认为血分蕴热、由热生毒、毒损血络是银屑病的重要病机，并提出优化方——凉血解毒汤。临床研究[2]表明，凉血解毒汤在寻常型银屑病的治疗中效果良好，有效率为92.1%。但其作用机制尤其配伍解毒类中药在其中发挥的作用尚不十分明确。

目前学术界普遍认为，不同亚群的T 淋巴细胞、树突状细胞以及中性粒细胞等在不同程度上参与了银屑病的病理生理过程，而白细胞介素-23(interleukin-23，IL-23)/IL-17 轴在银屑病的发病和病程进展中起关键作用[3-4]。因此，本实验通过咪喹莫特诱导小鼠银屑病样皮损来观察凉血解毒汤与凉血汤是否可以通过抑制IL-17、IL-23、IL-1β等相关细胞因子表达，从而起到治疗银屑病的作用，并进一步对比凉血解毒汤与凉血汤的各项指标，来探究解毒药的配伍应用在银屑病中的优势及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

BALB/c雄性小鼠55只，由华阜康生物科技股份有限公司提供，体质量18～20 g。实验动物使用许可证号：SYXK(京)2013-0002。

1.2 药物与试剂

凉血汤是首都医科大学附属北京中医医院协定处方，组成为生槐花15 g，生地黄15 g，赤芍10 g，丹皮10 g，白茅根30 g，防风10 g，白鲜皮10 g；凉血解毒汤是参考赵炳南老先生宝贵经验并深入研究银屑病的基础上，形成的银屑病优化方，组成为土茯苓30 g，紫草10 g，白花蛇舌草30 g，草河车9 g，板蓝根15 g，生槐花15 g，生地黄15 g，赤芍10 g，丹皮10 g，白茅根30 g，防风10 g，白鲜皮10 g。中药材统一由首都医科大学附属北京中医医院中药房提供。按照成人标准体质量(60 kg)并根据人与动物间药物剂量换算比例，计算小鼠灌胃所用的临床等药量，以中药常规煎服法制备水煎剂。

咪喹莫特乳膏购自四川明欣药业；凡士林购自河北兰炼飞天石化；甲氨蝶呤片购自上海信谊药厂；兔和鼠二步法检测试剂盒，DAB显色剂购自中杉金桥生物技术有限公司； 增生细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)及CD3一抗工作液、生物素标记二抗工作液购自美国Abcam公司；TRNzol 总RNA 提取试剂购自天根生化科技有限公司; PrimeScriptTMRT reagent 试剂盒购自美国TaKaRa公司，IL-17、IL-23、IL-1β、Actin引物购自美国Invitrogen公司。

1.3 仪器与设备

独立通气笼具及配套饲养系统、高速冷冻离心机(Centrifuge 5415D)购自德国Eppendorf公司；-80 ℃冰箱、脱水机(ASP6025)、包埋机(EG1150)、石蜡切片机(RM2255)、烤片机(HI1220)、HE半自动染色仪(AUTOSTAINER XL)均购自德国Leica公司；恒温水浴锅、5%(体积分数)CO2恒温培养箱、正置显微镜及图像分析系统(IMAGER Z2)购自德国Zeiss公司；荧光定量PCR仪(ABI7500)购自美国Applied Biosystems公司。

1.4 模型制备及分组给药

参考van der Fits等[5]银屑病样动物模型制备方法。将小鼠通过腹腔注射戊巴比妥钠(80 mg/kg)进行麻醉，并将其背部约 2 cm×2 cm毛发剃除。采用数字表法随机将备皮小鼠分为对照组、模型组、凉血汤组、凉血解毒汤组以及甲氨蝶呤组，于独立通气笼具中单笼饲养。对照组小鼠于备皮区每日涂抹凡士林42 mg,其余各组涂抹42 mg 5%(质量分数)咪喹莫特乳膏[1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并(4,5-C)喹啉-4-胺]；对照组与模型组小鼠每日1次0.2 mL 蒸馏水灌胃，凉血汤组与凉血解毒汤组给予等量的100%中药溶液，甲氨蝶呤组给予等量1 mg/kg 甲氨蝶呤片溶液，持续至第7天。

1.5 检测指标与方法

1)小鼠银屑病样皮损面积和疾病严重程度(psoriasis area and severity index，PASI)评分：于模型建立及治疗期间，观察各组小鼠皮损变化，并采用数码相机拍照方式每日记录；依据PASI评分标准，对鳞屑、浸润及红斑的严重程度进行评分,并计算总分，取平均值绘制趋势线，以反映小鼠皮损的变化情况。

2)皮损表皮屏障功能检测：分别于模型建立的第1、7天，采用皮肤水分油分测试笔，在一定温度(20～25 ℃)、湿度(40%～60%)的环境中，对小鼠备皮区皮肤进行检测。记录其结果并分析。

3)皮损组织形态学观察：于模型建立及治疗第7天取材,将小鼠银屑病样皮损组织取下置于4%(质量分数)甲醛中，固定后使用仪器进行常规脱水、包埋及切片，将组织置于载玻片上固定并行HE染色。光镜下观察皮肤组织学改变并测量其表皮层厚度。采用GraphPad Prism 6软件绘制皮损表皮层厚度柱状图，并结合SPSS 17.0统计分析。

4)皮损表皮基底层角质形成细胞的PCNA表达：取材及组织成片步骤同前，将组织脱蜡水化并高热修复后，加3%(体积分数) H2O2灭活内源性过氧化物酶，PBS清洗，依次滴加血清封闭液、1∶100稀释的PCNA一抗工作液、生物素标记二抗工作液，避光条件下DAB显色，最后树胶封片。光镜下观察各组小鼠皮损表皮基底层中PCNA阳性表达情况，并于400倍镜下每组织随机选取5个视野，计算其阳性比例并做出统计分析。

5)皮损真皮层中CD3阳性T细胞：取材、成片及免疫组织化学染色步骤同前，光镜下观察皮损真皮层中CD3阳性T细胞情况。并于400倍镜下每组织随机选取5个视野，计算其个数并做出统计分析。

6)皮损IL-17、IL-23及IL-1β mRNA的检测：于模型建立及治疗第7天取各组小鼠皮损，用TRIzol试剂提取组织mRNA，通过RT-PCR法进行实时荧光定量PCR检测。采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析，进一步采用GraphPad Prism 6软件绘制直方图，并结合SPSS 17. 0统计分析。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 凉血解毒汤与凉血汤对咪喹莫特诱导的银屑病样模型小鼠皮损的影响

观察各组小鼠皮损变化，对照组小鼠背部皮肤始终光滑粉嫩，除颈部有少量褶皱外，无鳞屑、红斑及浸润现象；模型组小鼠皮肤从第2～3天开始出现浸润褶皱及淡粉色斑点，并附有少量鳞屑，随着时间的推移，皮损逐渐严重，直至第7天达到高峰，皮肤变厚变硬，鳞屑增多增厚呈片状，脱落后多见筛状出血点，红斑由淡粉色变成暗红色，并融合成凸起的斑块，形成典型的银屑病样皮损。与模型组小鼠相比，凉血汤组、凉血解毒汤组及甲氨蝶呤组小鼠同期鳞屑浸润红斑症状明显减轻，其中凉血解毒汤组小鼠的鳞屑浸润症状总体较凉血汤组及甲氨蝶呤组改善明显，详见图1。

依据PASI评分标准绘制趋势线，直观可见对照组小鼠浸润、红斑、鳞屑及总评分趋势线始终保持在0左右，而其余各组小鼠分值不同程度持续升高，于第7天达到高峰；与模型组相比，甲氨蝶呤组、凉血汤组及凉血解毒汤组的鳞屑、浸润、红斑及总体评分均有所降低，差异有统计学意义(P<0.05)，而凉血解毒汤组在鳞屑、浸润方面作用更为显著(P<0.01)，详见图2。

2.2 凉血汤与凉血解毒汤对咪喹莫特诱导的银屑病样模型小鼠表皮屏障功能的影响

分别于第1天和第7天每组取8只小鼠检测其皮肤的水分与油分含量，结果显示与对照组比较第1天各组小鼠差异无统计学意义，治疗7天后，模型组小鼠皮肤中水分、油分含量明显较低；凉血解毒汤组小鼠皮损油分与水分含量较模型组有所改善；而甲氨蝶呤组与凉血汤组无明显改变，详见表1。

2.3 凉血解毒汤与凉血汤对咪喹莫特诱导的银屑病样模型小鼠皮损组织形态学变化的影响

经HE染色，光镜下观察第7天各组小鼠皮损组织形态：对照组小鼠皮损表皮层相对较薄，真皮层较为紧密。模型组与其相比，表皮增生明显并伴有角化不全，可见Munro微脓肿，形成银屑病样皮损。凉血汤组、凉血解毒汤组及甲氨蝶呤组较模型组有不同程度的缓解，其中凉血解毒汤组优于凉血汤组及甲氨蝶呤组,详见图3。

图1 各组小鼠第7天皮损表现Fig.1 Gross observation of mice at day 7 of treatment

图2 咪喹莫特诱导的各组小鼠1～7 d皮损PASI评分趋势Fig.2 PASI scores of mouse skin lesions induced by imiquimod

表1 各组小鼠皮肤第7天油分与水分含量比较Tab.1 Comparison of oil and water component in skin lesions at day 7 after treating

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通过IPP测量表皮层的垂直厚度: 模型组表皮层较对照组明显增厚约3～4倍，凉血汤组与凉血解毒汤组表皮层厚度较模型组降低(P<0.001)，差异有统计学意义，其中凉血解毒汤组优于凉血汤组，与甲氨蝶呤组相似，详见图4。

2.4 凉血汤与凉血解毒汤抑制咪喹莫特诱导的银屑病样模型小鼠皮损中PCNA的表达

免疫组织化学染色法观察各组小鼠表皮基底细胞的PCNA阳性表达：对照组小鼠表皮仅基底层细胞有增生迹象，约1～2 层，呈散在的点状或连续的线状排列; 与对照组相比，模型组在表皮层中细胞阳性表达增加异常明显达5～6层；而与模型组相比，凉血解毒汤组表皮细胞增生有所降低，约2～3层，凉血汤组与甲氨蝶呤组相似，约3～4层，结果详见图5。

图4 各组小鼠第7天表皮层厚度比较Fig.4 Comparison of epidermis thickness in skin lesions at day 7 of treatment

通过IPP测量表皮的PCNA阳性细胞百分比，每组小鼠各取6个标本，每个标本各取5个视野，结果显示与前一致，详见表2。

2.5 凉血汤与凉血解毒汤抑制咪喹莫特诱导的银屑病样模型小鼠皮损中CD3+T细胞的浸润

免疫组织化学染色法观察各组小鼠真皮层CD3阳性T细胞:对照组小鼠皮肤真皮层中CD3+T细胞较少；模型组小鼠免疫组织化学染色可见表皮和真皮层均散在分布较多CD3+T细胞，与正常对照组小鼠相比，二者差异有统计学意义；凉血汤组、凉血解毒汤组及甲氨蝶呤组小鼠皮损组织中CD3+T细胞个数低于模型组，其中以凉血解毒汤组最为明显，详见图6。

表2 各组小鼠第7天皮损表皮PCNA 阳性细胞百分比Tab.2 Comparisons of the percentages of PCNA positive cells

图5 各组小鼠第7天皮损中PCNA表达Fig.5 PCNA expression of skin lesions at day 7 (immunohistochemical staining,400×)

通过IPP测量真皮层中的CD3阳性T细胞个数，每组小鼠各取6个标本，每个标本各取5个视野，结果显示与前一致，详见表3。

2.6 凉血汤与凉血解毒汤对咪喹莫特诱导的银屑病样模型小鼠皮损中相关细胞因子表达的影响

经咪喹莫特诱导的银屑病样模型小鼠皮损中IL-17 mRNA、IL-23 mRNA 及IL-1β mRNA的相对表达量均高于正常对照组，而凉血解毒汤可明显抑制其表达，凉血汤仅对 IL-1β mRNA具有较明显的抑制作用，对IL-17 mRNA及IL-23 mRNA相对表达量的影响与模型组相比差异无统计学意义,详见图7。

表3 各组小鼠第7天表皮皮损CD3阳性细胞个数Tab.3 Comparisons of the numbers of CD3-positive T cells

图6 各组小鼠第7天皮损中CD3表达Fig.3 CD3 expression of skin lesions at day 7 (immunohistochemical staining, 400×)

图7 各组小鼠第7天皮损中IL-17 mRNA、IL-23 mRNA及IL-1β mRNA相对表达量Fig.3 Comparisons of the expressions of IL-17 mRNA, IL-23 mRNA, IL-1β mRNA in skin lesions at day 7 after treating

3 讨论

银屑病是常见的慢性炎性反应增生性皮肤病，病程长、易复发[6]。在中医临床治疗中以“清热凉血”为主，其代表方剂凉血汤为北京中医医院赵炳南老先生的经验方，方药组成为生槐花、生地黄、赤芍、丹皮、白茅根、白鲜皮、防风等7味凉血中药。北京中医医院在参考老先生宝贵经验的同时，深入研究了银屑病病机，协定增加土茯苓、紫草、白花蛇舌草、草河车及板蓝根等5味解毒中药，共同配伍形成银屑病的优化方——凉血解毒汤。

本实验结果显示，凉血解毒汤与凉血汤均可降低皮损PASI评分及表皮厚度，同时降低PCNA阳性细胞百分比，减少CD3阳性细胞个数，并下调IL-1β mRNA相对表达量(P<0.05)，但凉血解毒汤在改善咪喹莫特诱导的银屑病样皮损、抑制角质形成细胞增生分化(5.66±0.057，P<0.01)以及减轻炎性浸润(10.670±0.193，P<0.01)等方面，明显较凉血汤更为优化，且在一定程度上还可改善皮肤屏障功能(水分16.980±2.739、油分7.750±1.209，P<0.05)，并抑制IL-17、IL-23 mRNA 在皮损中的表达(P<0.05),而凉血汤组小鼠皮损油分、水分含量及IL-17、IL-23 mRNA的相对表达量与模型组相比，差异均无统计学意义(P>0.05)。因此推测，凉血汤可通过抑制IL-1β mRNA的表达，进而减少炎性浸润，改善咪喹莫特诱导的银屑病样炎性反应皮损；而凉血解毒汤可通过增加配伍解毒药提升其在促进皮肤屏障功能恢复、抑制炎性浸润等方面的干预作用，尤其对IL-23、IL-17 mRNA表达的抑制，能够更好的改善鳞屑、浸润及红斑等咪喹莫特诱导的屑病样皮损。

IL-23与IL-17是参与银屑病发病机制的重要炎性反应因子。临床上靶向IL-23 /IL-17 轴的全人源性和人源化单克隆抗体在治疗中重度斑块状银屑病及银屑病性关节炎上疗效显著，应用IL-17拮抗剂secukinumab 治疗中重度斑块状银屑病[7],显著疗效达到PASI 90/100,并对PASI 75 有良好的维持疗效[8]。那么解毒药在银屑病中的作用机制是否与其对IL-17、IL-23及IL-1β等相关炎性反应因子的抑制有内在联系呢？

北京中医医院及北京市中医研究所提出的“血分蕴毒”理论中，首次将“毒”分为外来之毒如细菌、病毒等，内生之毒如代谢废物、炎性反应介质等，而银屑病的病理学基础与局部炎性反应有密切关系[9]，这提示的中药解毒功效与现代医学抗炎作用有内在联系的推论与本实验结果相吻合。现代研究[10]也证实了这个观点，如本实验用方中加减的5味中药各自成分：白花蛇舌草主要成分白花蛇舌草总黄酮可通过核转录因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)和MAPK信号通路抑制脂多糖诱导的巨噬细胞中的炎性反应，同时可增强机体的免疫功能；土茯苓的主要成分落新妇苷可通过JAK3/STAT3信号通路抑制Th17细胞的分化，进而改善咪喹莫特诱导的银屑病样模型小鼠皮损[11]；板蓝根提取液对多种炎性反应均有抗炎抑制作用，如二甲苯导致的小鼠耳肿胀，角叉菜胶导致的人鼠足跖肿和人鼠棉球肉芽组织增生，以及醋酸导致的小鼠毛细血管通透性增加等[12]；草河车提取物可显著抑制丙酸杆菌[13];紫草主要成分紫草素可降低血清中Th17细胞相关炎性反应因子IL-17、IL-17F、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α， TNF-α)、IL-6、IL-22等表达，从而改善银屑病样皮损及其组织病理变化[14];而其他常见的解毒类中药如玄参，其主要化学成分Scropolioside A[15]不仅能通过抑制NF-κB 减少干扰素-γ、TNF-α以及IL-1β等炎性反应因子的表达，从而使T 细胞的周期停滞于S 期，最终使淋巴细胞的生理与病理作用减弱，还可有效降低环氧化酶-2与一氧化氮合成酶-2等促炎性反应酶表达，治疗皮肤迟发型超敏反应。

综上所述，解毒药与凉血药配伍可提升其对咪喹莫特诱导的银屑病模型小鼠皮损的干预作用。凉血解毒汤在改善皮肤屏障功能，改善皮损组织形态变化、减缓表皮角质形成细胞增生、减少角化不全细胞及降低炎性浸润程度等方面，明显优于单纯的凉血汤，而优势药物解毒类中药的功效与抗炎作用有内在联系，其在银屑病治疗中的作用靶点可能在IL-23、IL-17等相关炎性反应因子，因IL-23与IL-17是IL-23/IL-17炎性反应轴的重要参与者，因此对下一步解毒药的具体作用机制的探讨提供了思路，本研究结果不仅表明解毒药在银屑病的治疗中发挥了至关重要的作用，并且反向为银屑病“血分蕴毒”的病因病机理论提供了依据。然而对于解毒药与凉血药配伍是如何多靶点、多角度的通过调节免疫反应发挥治疗银屑病的机制[16]，仍有待于进行深入研究。

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