氯沙坦对血管紧张素Ⅱ诱导人肾小球系膜细胞衰老作用机制的研究

焦素敏，傅淑霞，温丽颖，闫 喆，李绍梅

肾脏功能随年龄增长而下降，衰老是肾脏疾病进展的重要风险之一。目前导致肾脏衰老的机制仍未完全清楚，在众多调控因素中氧化应激与肾素-血管紧张素系统(RAS)起着重要作用[1]。血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)为RAS系统的主要效应因子，已证实AngⅡ可以刺激内皮细胞、血管平滑肌细胞和血管成纤维细胞过氧化物的产生，导致氧化应激[2-4]。氧化应激是造成衰老的主要因素之一，其中自由基和活性氧(ROS)在生物大分子的氧化中起着重要的作用[5]，抑制氧化应激及AngⅡ受体信号途径可减轻年龄相关的高血压和代谢异常[6]。氯沙坦为AngⅡ的Ⅰ型受体拮抗剂,可阻断AngⅡ与其Ⅰ型受体结合,从受体水平拮抗其生物学效应,从而降低肾小球毛细血管内压,改善肾血流动力学异常,缓解早期的高滤过、高灌注状态,减少尿蛋白,保护肾功能。既往研究证明，氯沙坦能够改善老年冠心病患者内皮功能[7]，可以抑制结缔组织生长因子(CTGF)、纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)的表达,抑制细胞外基质的积聚,从而延缓D-半乳糖致大鼠肾脏的衰老[8]，而在急性冠状动脉综合征患者中，氯沙坦可减轻微粒诱导的内皮细胞的衰老[3]。氯沙坦作为AngⅡ的Ⅰ型受体拮抗剂，在各种原发及继发肾脏疾病中广泛应用，然而其是否可以减轻系膜细胞的衰老，及其可能的作用机制尚不清楚。本研究通过本课题组前期所建立的人肾小球系膜细胞衰老模型,即：培养至5～8代的细胞，用10-6mol/L AngⅡ刺激72 h[9]，观察氯沙坦对AngⅡ诱导的人肾小球系膜细胞(HMCs)衰老的影响,细胞内ROS的变化,并测定p53、p21蛋白的表达,探讨氯沙坦保护HMCs衰老的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 HMCs购于美国Sciencen公司。细胞在系膜细胞专用培养基(MsCM, ScienCell, USA)中培养，培养至5～8代的细胞用于实验。氯沙坦(德国Merck公司)，AngⅡ(美国Sigma公司),细胞衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒和ROS检测试剂盒(中国碧云天)。小鼠抗人多克隆抗体β-actin,p21,兔抗人多克隆抗体P53(美国Santa Cruz)。

1.2实验分组和处理 对照组:在不含AngⅡ的MsCM培养液中培养；Ang组:10-6mol/L AngⅡ刺激细胞72 h；氯沙坦+AngⅡ组:AngⅡ加入前l h加入10-5mol/L氯沙坦培养72 h。AngⅡ和氯沙坦的刺激浓度和时间由前期实验所得[9]。

1.3SA-β-gal染色 各组细胞培养72 h后，PBS清洗细胞1次，按试剂盒说明书进行操作，染色后于37℃无CO2培养箱中孵育过夜，衰老的细胞染色后呈蓝绿色，镜下随机选取6个视野分别计数衰老细胞数和总细胞数，计算SA-β-gal阳性细胞的百分率。

1.4流式细胞仪检测细胞周期 各组细胞培养72 h后，用0.25%的胰蛋白酶消化制成单细胞悬液。60 g/min离心5 min，弃去培养液，PBS洗2次。加入70%冷乙醇4℃固定过夜，离心去乙醇。PBS洗2次后，悬浮于0.5 ml PBS中，分别加入RNaseA和PI 4℃避光显色30 min上流式细胞仪对细胞周期进行检测及分析。

1.5流式细胞仪检测细胞内ROS 参照碧云天试剂盒说明书操作，即按1∶1000用无血清培养液稀释荧光探针DCFH-DA，使终浓度为10 μmol/L。各组细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为1×106～2×108/ml，37℃细胞培养箱内孵育20 min。每隔3～5 min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。流式细胞仪检测细胞内ROS水平。

1.6蛋白免疫印迹法检测p53、p21蛋白表达 各组细胞培养至相应时间后，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取50 μg蛋白加含β-巯基乙醇的上样缓冲液，并于沸水中煮5 min，用12%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分离。电泳后电转至PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭，加兔抗人p53多克隆抗体(1∶400)，鼠抗人多克隆抗体β-actin(1∶500)，p21(1∶200)4℃摇床过夜，1×TBST洗膜3次，加二抗辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶8000)，山羊抗鼠IgG(1∶8000)孵育杂交，室温2 h,将ECL(增强化学发光)试剂盒中的A液和B液等量混合，滴加于膜上，反应1 min后，在发光仪上发光。

2 结果

2.1细胞SA-β-gal染色变化 对照组、AngⅡ处理组和氯沙坦干预组SA-β-gal染色阳性细胞百分率分别为(13.03±0.96)%、(80.64±1.34)%、(29.37±0.78)%。对照组和氯沙坦干预组SA-β-gal染色阳性细胞百分率低于AngⅡ处理组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

2.2细胞周期变化 对照组、AngⅡ处理组和氯沙坦干预组G0/G1期细胞比例分别为(52.81±2.53)%、(77.18±1.11)%和(60.6±0.80)%。对照组、氯沙坦干预组G0/G1期细胞比例低于AngⅡ处理组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

图2 3组人肾小球系膜细胞细胞周期变化

2.3细胞内ROS水平变化 AngⅡ处理组人肾小球系膜细胞ROS水平高于对照组和氯沙坦干预组(P<0.05)。见图3。

图3 3组人肾小球系膜细胞细胞内活性氧含量变化

2.4p53和/p21蛋白表达水平的变化 AngⅡ处理组p53和/p21蛋白较对照组增高，氯沙坦干预组低于AngⅡ处理组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 3组人肾小球系膜细胞p53和/p21蛋白表达水平

3 讨论

许多年龄相关疾病(age-related disease， ARD)包括心脑血管疾病、神经退行性变、肾脏疾病等发病率也在逐年增高。其中肾脏是受年龄影响比较明显的器官之一，肾小球滤过率(GFR)随年龄增长每年下降0.40～1.02 ml/min[10],老年肾脏疾病正逐渐成为影响人们健康和社会发展的主要疾病，因此研究肾脏衰老机制及研发干预药物具有重要意义。

关键细胞的衰老是器官和组织衰老的病理基础，肾小球系膜细胞作为肾脏重要的固有细胞，其表型和功能的改变在肾脏衰老进程中必然发挥着重要的作用。多数正常细胞在体外培养时不能无限传代，而是经过一个时期的增殖后，分裂速度降低，最后停止，对任何有丝分裂原无反应，称为“复制性衰老”。有研究报道，正常细胞在各种应激下，如DNA损伤、氧化应激、癌基因激活等，可以快速进入衰老，称为“应激性衰老”[11]。有关衰老机制的假说和理论众多，如基因功能紊乱、线粒体损伤和干细胞耗竭等[12]。然而，目前最公认的衰老学说之一仍是氧化应激学说。在正常情况下，机体处于氧化与抗氧化的动态平衡状态，从而保护机体免受损伤。随着年龄增长或在外界有害刺激因素下，机体内ROS的数量会显著增多，造成脂质过氧化反应，引起机体内包括蛋白、核酸等的氧化损伤，对细胞功能和活性造成损害，可以说衰老是自由基损伤性效应的综合结果[13-14]。多种分子通路参与调控衰老的过程，如MAPK/NF-kB通路、抑癌基因PTEN、Klotho蛋白等[15-17]，但是现公认各种诱发细胞衰老的信号最后主要通过p53-p21-PRb途径和p16-PRb途径导致衰老[18]，细胞衰老后具有细胞周期阻滞于G0/G1期、SA-β-gal表达增加等特征性改变。

p53蛋白不仅是重要的细胞周期、凋亡调节因子，还是细胞衰老过程中重要的调节因子，能感知衰老相关信号的刺激，如端粒缩短、DNA损伤等。p53被激活时结合到DNA特殊的序列上并增强其下游靶基因的表达。p53活化的一个主要效应分子就是p21，p21蛋白为广谱的细胞周期蛋白,是依赖于细胞周期蛋白激酶(CDK)的抑制物，p21水平上调可抑制CDK2和CDK4的活性,使其不能磷酸化视网膜母细胞瘤抑制蛋白(Rb)，Rb是CDK4-6/D激酶的主要底物，处于非磷酸化或低磷酸化形式的Rb可与转录因子E2F结合，屏蔽其转录激活结构域，抑制其转录活性，而后者能激活重要的细胞周期蛋白E和A，启动DNA复制，从而抑制了从G1期进入S期所需的下游基因的表达，使细胞周期停滞[16]。

有研究证实，RAS系统参与器官衰老过程[19-20],血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)可降低肾小球内压和蛋白尿，减轻局灶节段性肾小球硬化和间质纤维化。氯沙坦作为血管紧张素受体拮抗剂经典药物之一，广泛用于各种肾脏疾病，但对于其在肾小球系膜细胞衰老中的作用报道尚少。

本实验应用AngⅡ刺激HMCs，成功建立HMCs衰老模型，衰老细胞中p53、p21蛋白表达增多，说明p53/p21通路参与了AngⅡ诱导的HMCs的衰老过程，应用氯沙坦干预后，细胞内ROS水平降低，p53、p21表达下降，提示氯沙坦可能通过减轻氧化应激，调控p53/p21通路而延缓HMCs的衰老过程，为临床应用氯沙坦治疗衰老相关性肾脏疾病提供了理论依据,但是具体应用到临床还有待于基础研究的进一步深入和大规模的临床实验来证实。另外，至于P16-PRb通路是否也参与了AngⅡ诱导的HMCs的衰老过程亦需要进一步证实。

[参考文献]

[1] Gekle M. Kidney and aging-A narrative review[J].Exp Gerontol, 2017,87(Pt B):153-155.

[2] de Cavanagh E M, Piotrkowski B, Fraga C G. Concerted action of the renin-angiotensin system, mitochondria, and antioxidant defenses in aging[J].Mol Aspects Med， 2004，25(1-2):27-36.

[3] Abbas M， Jesel L， Auger C，etal. Endothelial Microparticles From Acute Coronary Syndrome Patients Induce Premature Coronary Artery Endothelial Cell Aging and Thrombogenicity: Role of the Ang Ⅱ/AT1 Receptor/NADPH Oxidase- Mediated Activation of MAPKs and PI3-Kinase Pathways[J].Circulation, 2017,135(3):280-296.

[4] Zhou T, Zhang M, Zhao L,etal. Activation of Nrf2 contributes to the protective effect of Exendin-4 against angiotensin II-induced vascular smooth muscle cell senescence[J].Am J Physiol Cell Physiol, 2016,311(4):C572-C582.

[5] Sohal R S, Mockett R J, Orr W C. mechanisms of aging: an appraisal of the oxidative stress hypothesis[J].Free Radic Biol Med, 2002,33(5):575-586.

[6] Hezel M, Peleli M, Liu M,etal. Dietary nitrate improves age-related hypertension and metabolic abnormalities in rats VIA modulation of angiotensin Ⅱ receptor signaling and inhibition of superoxide generation[J].Free Radic Biol Med, 2016,99:87-98.

[7] 黄瑛.氯沙坦对老年冠心病患者EPCs动员作用及改善血管内皮功能的机制研究[J].中国现代医生,2014,52(27):30-32,35.

[8] 李垚,冯欣,王雪鹰.氯沙坦对D-半乳糖致衰老大鼠肾脏的保护作用[J].中国老年学杂志,2010,22(30):3343-3345.

[9] Zhou H, Huang B, Du J,etal. Role of the JAK2/stat pathway and losartan in human glomerular mesangial cell senescence[J].Mol Med Rep, 2010,3(3):393-398.

[10] Wetzels J F, Kiemeney L A, Swinkels D W,etal. Age- and gender-specific reference values of estimated gfr in caucasians: the nijmegen biomedical study[J].Kidney Int, 2007,72(5):632-637.

[11] Ben-Porath I, Weinberg R A. When cells get stressed: an integrative view of cellular senescence[J].J Clin Invest, 2004,113(1):8-13.

[12] 莫睿，魏智民，杨云生.抗衰老机制研究进展[J].解放军医学杂志,2017,42(8):743-748.

[13] Donato A J， Walker A E， Magerko K A，etal. Life-long caloric restriction reduces oxidative stress and preserves nitric oxide bioavailability and function in arteries of old mice[J].Aging Cell, 2013,12(5):772-783.

[14] 周溦，林敬明，王素丽，等.半枝莲总黄酮对延缓秀丽隐杆线虫和人脐静脉内皮细胞衰老的影响[J].南方医科大学学报，2017,37(6):821-826.

[15] 宋来新,张长城,王婷,等.淫羊藿总黄酮通过抑制MAPK/NF-kB信号通路减轻自然衰老大鼠脑组织炎症反应[J].中国药理学通报,2017,33(1):84-90.

[16] 刘小莺,吴莉，陈洲，等.PTEN抑制剂对高糖诱导的内皮细胞衰老的影响[J].中国药理学通报,2016,33(4):514-519.

[17] 管旭，赵景宏.Klotho与FGF信号通路关系的研究进展[J].解放军医药杂志,2014,26(10):109-113.

[18] Muller M. cellular senescence: molecular mechanisms, in vivo significance, and redox considerations[J].Antioxid Redox Signal, 2009,11(1):59-98.

[19] Yoon H E, Choi B S. The renin-angiotensin system and aging in the kidney[J].Korean J Intern Med, 2014,29(3):291-295.

[20] de Cavanagh E M, Inserra F, Ferder L. Angiotensin ii blockade: a strategy to slow ageing by protecting mitochondria?[J].Cardiovasc Res, 2011,89(1):31-40.