miR-214对PTEN蛋白的影响及其在胃癌细胞中的生物学行为

周晓刚,王 凯,沈小刚,王 林,覃先鹏

胃癌是全球恶性肿瘤中第二大常见的死亡病因，每年估计有100万新诊断的胃癌患者，病死率约为10%[1-4]。胃癌是一种复杂的遗传性疾病，有研究表明，几种致癌基因和肿瘤基因抑制因子与胃癌发生、进展有密切关系[5-8]，但目前最常见胃癌遗传性分子机制尚未被阐明，所以探讨胃癌细胞中的新的分子生物学的作用方式及机制是目前的研究热点。微小RNA(miRNAs)是一类小型的非编码核苷酸，长度为18～25 nt[9-10]。目前多种miRNA已被发现在不同的人类恶性肿瘤组织中存在异常表达，可以通过结合负向调节的靶基因因子，对其3'非翻译区(3'-UTR)进行上调或下调，进而影响相关信号通路的激活起到促癌或抑癌的作用[11]。近年来，越来越多的实验证据表明miRNAs在肿瘤细胞的生物学行为过程中起重要的调控作用，如细胞增殖、分化、迁移和侵袭等[12-13]。最近一项研究确定了不同的miRNA在胃癌组织中的表达差异情况，22种miRNA在胃癌组织中表达上调，其中包括miR-214[14]。但是，关于miR-214在胃癌具体作用机制及相关作用靶标尚不清楚。本研究调查了miR-214在胃癌组织和细胞株中的表达水平，并通过生物信息学预测PTEN蛋白和miR-214结合序列的相似关系，进一步研究miR-214和PTEN在胃癌细胞株中的调控关系和对生物学行为的影响，为胃癌的发生、发展过程提供一定分子生物学基础。现报告如下。

1 资料与方法

1.1临床标本采集与处理 收集2016年6—12月在医院手术切除且经病理检查确诊为胃癌的组织60例，同时取癌旁正常胃组织60例。离体后放入4%多聚甲醛溶液中固定。所有患者术前无化疗或放疗，胃癌为原发病灶并经病理科证实，签署知情同意书。

1.2细胞株与主要试剂 人胃癌细胞SCG-7901、MGC-803、MGC-823及293U实验细胞株购买于上海细胞研究所。细胞培养条件：含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，37℃，5% CO2条件下培养。胎牛血清、RPMI 1640培养基均购自Gibco公司。PTEN蛋白兔单克隆抗体购于Abcam(ab32199)。Transwell小室购自美国Millipore公司，Matrigel购自美国BD公司。miR-214-siRNA、PTEN-mimic及对照慢病毒购自上海吉凯制药技术有限公司。miR-214 qPCR引物以及RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、PCR试剂盒均购自上海吉玛基因有限公司。

1.3RNA提取和qPCR过程 EP管中加入500 μl的lysis buffer。细胞直接收集好后加入其中裂解。Trozel裂解液提取组织总RNA，逆转录，PCR扩增miR-214，使用U6作为内参。反应条件：以100 ng总RNA为模版，逆转录cDNA，反应条件为：37℃ 15 min，95℃ 5 min。后根据Kapa PCR试剂盒说明书进行PCR反应。获得数据以RQ=2-ΔΔCT计算mRNA表达量。实验重复3次。miR-214引物，上游引物：5′-CGTGTGTAGTCGTAGTCGTGTGACGAT-3′；下游引物：5′-GGCTGTCGATGTAAATGCGCTGATCGA-3′。

1.4实验分组及细胞株处理 分为miR-214-siRNA组、PTEN-mimic组、对照组和miR-214-siRNA+PTEN-mimic组。将miR-214-siRNA转染MGC-803细胞作为miR-214-siRNA组；对照组为阴性对照，将对照组mimic转染MGC-803细胞；miR-214-siRNA+PTEN-mimic组将PTEN-mimic转染MGC-803细胞(已转染miR-214-siRNA mimic)。

1.5双荧光素酶活性测定 将24孔板中的293U细胞与0.4 mg荧光素酶报告载体和0.1 mg含有海肾萤光素酶的pRL-TK对照载体共转染，根据siPORTneoFX使用方法操作，在转染后48 h制备裂解物。使用双荧光素酶报告基因测定系统，转染24 h后测定荧光素酶活性。对于每个转染的萤火虫萤光素酶活性被归一化为海肾萤光素酶活性。实验重复3次。miR-214的引物序列：5'-CATTTATCCCTTCTATTGCTGGGCTTTC-3'(正向)和5'-GAGGGCCATAAAAAGCAGAAAGTAATG-3'(反向)。PTEN的引物序列：5'-TGCTGTAGTCGATGCGCGAGTGGCTAGC-3'(正向)和5'-CGTGTGATGTCGATGTCGACGGGGA-3'(反向)。

1.6MTT增殖实验 将对数期MGC-803胃癌细胞使用胰蛋白酶消化后，制成单细胞悬浮液并以1×103个/孔的密度接种到96孔板中。在细胞培养7 d后，加入20 μl MTT测定液，每孔充分混合均匀，并在37℃下孵育4～6 h。然后使用无菌吸管吸出上清液，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，在室温下搅拌10 min保证晶体充分溶解。然后在96 h进行MTT测定波长为490 nm时的吸光度，计算MGC-803细胞的增殖情况。实验重复3次。

1.7Transwell侵袭实验流程 在24孔板中接种胃癌MGC-803细胞，同时转染miR-214-siRNA抑制miR-214的表达，常规条件培养24 h。将处理过的各组细胞用胰酶消化,继而用无血清培养液重悬成细胞悬液备用。将培养小室放入孔板中，小室下层加有胎牛血清的培养液，小室内则加入2×104个/ml的胃癌细胞悬液常规培养48 h后取出小室，用甲醇固定，结晶紫染色15 min，用棉签小心擦去微孔膜上层细胞。在荧光显微镜下给微孔膜下层细胞拍照,每孔拍4个视野计算细胞数。实验重复3次。

1.8蛋白免疫印迹法检测蛋白表达水平 用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞总蛋白，并将其转移到硝酸纤维素膜(Bio-Rad，Hercules，CA)。使用5%脱脂牛奶充分封闭膜，并与一抗(PTEN浓度1∶2000)，内参GAPDH(浓度1∶2000)，4℃，孵育过夜。次日，TBST充分冲洗过后，使用二抗辣根酶标记物(浓度1∶2000)孵育2 h，TBST充分冲洗过后，使用碧云天化学发光试剂ECL显影液检测目标蛋白的表达水平。使用GAPDH作为蛋白内参对照。实验重复3次。

2 结果

2.1miR-214和PTEN在胃癌组织和细胞株中的表达水平 miR-214在胃癌组织和癌旁正常胃组织中的表达水平分别为5.86±0.76和1.84±0.23。miR-214在胃癌组织中的表达水平高于癌旁正常胃组织(P<0.05)。PTEN蛋白在胃癌组织和癌旁组织中的表达水平分别为5.23±0.83和2.79±0.46。PTEN蛋白在胃癌组织中的表达水平高于癌旁正常胃组织(P<0.05)。MGC-803、MGC-823、SGC-7901胃癌细胞株中miR-214的表达水平分别为4.25±0.92、2.34±0.52、2.34±0.52。MGC-803胃癌细胞株中miR-214的表达水平高于MGC-823、SGC-7901(P<0.05)。上述实验结果表明miR-214和PTEN可能在胃癌中扮演促癌因子的作用，后续实验选取胃癌MGC-803细胞株作为研究对象。

2.2miR-214和PTEN间的调控关系 我们通过生物信息学网站预测发现miR-214和PTEN有相似的结合位点序列，二者之间可能存在一定的调控关系，推测PTEN的3'-UTR含有miR-214靶向结合序列。见图1。本研究将miR-214-siRNA与PTEN共转染到293U细胞中，双荧光素酶报告基因结果显示：过表达miR-214 PTEN活性为3.84±0.41，对照组为3.76±0.22，差异无统计学意义(P>0.05)；抑制miR-214表达后，PTEN活性为1.24±0.15，对照组为3.51±0.35，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图1 miR-214与PTEN之间的结合位点序列

2.3miR-214对胃癌细胞株PTEN蛋白表达水平、细胞增殖和侵袭能力的影响 miR-214-siRNA组PTEN的表达水平高于对照组。见图2。对照组和miR-214-siRNA组MGC-802细胞株的细胞增殖能力分别为0.59±0.12和0.28±0.05，48 h后穿膜细胞数分别为(150.36±11.35)和(52.31±6.32)个。miR-214-siRNA组MGC-802细胞株的细胞增殖能力较对照组弱，穿膜细胞数少于对照组(P<0.05)。见图3。

图2miR-214对胃癌细胞株PTEN蛋白表达水平的影响

图3miR-214对胃癌细胞侵袭能力影响(结晶紫染色×40)

2.4PTEN对胃癌细胞株PTEN蛋白表达水平、细胞增殖和侵袭能力负调控作用 与miR-214-siRNA组相比，miR-214-siRNA+PTEN-mimic组PTEN蛋白表达水平下调。见图4。miR-214-siRNA组和miR-214-siRNA+PTEN-mimic组MGC-802细胞株细胞增殖率为0.71±0.11和0.32±0.06，48 h后穿膜细胞数分别为(164.69±12.09)和(62.30±5.29)个。miR-214-siRNA+PTEN-mimic组MGC-802细胞株细胞增殖率高于miR-214-siRNA组，穿膜细胞数多于miR-214-siRNA组(P<0.05)。见图5。

图4 PTEN对胃癌细胞株PTEN蛋白表达水平影响

图5PTEN对胃癌细胞侵袭能力的的影响(结晶紫染色×40)

3 讨论

最近很多研究指出，表达失调的miRNA在各种类型的人类恶性肿瘤中起重要作用，miRNAs表达水平或活性的改变可能会通过调节多种类型靶基因表达诱导肿瘤的发生和发展[15-16]。因此，研究特异性miRNA及其在恶性肿瘤发生、发展过程中的具体作用及机制可以为恶性肿瘤的诊断及治疗提供理论支持和意见，也是目前肿瘤学领域较热门的研究方向。

miRNA是近年来新发现的一类小分子非编码RNA，其在细胞的增殖、凋亡、分化及迁移、侵袭等方面发挥着重要的作用，越来越多的研究指出miRNA在恶性肿瘤的发生、发展中扮演着重要的角色[17]。而关于miRNA在胃癌进展过程中的具体作用和相关机制及对胃癌诊断和治疗的指导应用也进行了很多基础研究，为胃癌的基因诊断和治疗提供了新靶点及研究方向。Wang等[17]研究指出，miR-214在胰腺癌中呈现高表达状态，miR-214可通过抑制ING4靶基因的表达调控胰腺癌细胞对化疗药物的敏感性。Wen等[18]研究发现，miR-214在宫颈癌组织中表达明显下调，而miR-214的表达水平与宫颈癌细胞株的迁移、侵袭能力有关，且与患者的临床预后呈负相关，其可能是通过抑制下游相关靶基因进行调控。曾有研究报道指出miR-214可以作为新的潜在治疗靶点对胃癌进行靶向治疗[19]。也有研究指出miR-214可通过靶向PTEN蛋白的表达诱导卵巢癌细胞对顺铂耐药，降低卵巢癌患者对顺铂的化疗耐药性[20]。前期部分研究已表明，miR-214与胃癌具有一定的相关性，但miR-214在胃癌发生、发展过程中的作用靶标和具体作用机制目前尚不清楚。所以本研究对胃癌组织和细胞株中miR-214表达情况及其在细胞生物学行为中的具体作用机制进行了探讨。本研究结果显示，与癌旁正常胃组织比较，miR-214表达水平在胃癌组织中明显上调，表明miR-214表达水平与胃癌患者的临床进展可能具有一定的相关性，与Yang等[21]的研究报道一致。因此，推测miR-214在胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭等行为中起到关键的调控作用。本研究通过生物信息学网站预测miR-214的靶基因，结果发现PTEN蛋白的3'UTR位点序列和miR-214位点序列有直接相关性，且miR-214可以直接调控PTEN的表达水平和活性。

PTEN是蛋白酪氨酸磷酸酶的同系物，其位于人染色体10q23区域，其在多种类型的肿瘤中扮演肿瘤抑制因子的角色[22]。据研究报道，PTEN可以干扰细胞的凋亡、增殖、迁移和侵袭等行为，以及通过影响血管生成信号通路的激活达到抑制肿瘤生长的作用[23-24]。最近有研究显示，上调PTEN蛋白的表达可以增加Caspase-3的表达，进而减缓肿瘤细胞的凋亡行为[25]。研究miR-214和PTEN在胃癌中的作用方式及对胃癌细胞生物学行为的影响是本实验的重点。本研究结果显示，抑制miR-214后，PTEN蛋白表达水平下调，胃癌MGC-803细胞的增殖能力和侵袭行为均受到一定程度的抑制，而同时增加PTEN蛋白的表达水平后，miR-214对胃癌MGC-803细胞增殖和侵袭行为的抑制在一定程度得到逆转，即MGC-803细胞的增殖和侵袭能力增强，表明PTEN在一定程度可与miR-214形成负反馈作用。二者共同调控胃癌细胞的生物学行为。

综上所述，本实验证明了miR-214在胃癌中呈现过表达状态，较低miR-214可显著抑制胃癌细胞的增殖和侵袭能力，miR-214和PTEN蛋白共同作用参与胃癌细胞的生物学行为的调控，但是是否有下游相关信号通路参与miR-214/PTEN的调控过程尚不清楚，拟下一步实验进行研究探讨。本实验为miR-214/PTEN在胃癌细胞的作用方式和机制的阐释提供了一定的理论支持，也为胃癌的诊断和治疗方向提供了新的基因靶点可能。

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