祁白术生物活性物质及其抗氧化、抑菌能力研究

吴永祥 - 江海涛 - 崔 朋

方建新1FANG Jian-xin1 王卫东3WANG Wei-dong3 胡长玉1HU Chang-yu1

祁白术简称祁术，为菊科植物白术(AtractylodesmacrocephalaKoidz·)的干燥根茎，因仅野生分布于安徽祁门及附近地区而得名。祁白术在当地民间被视为珍贵补品，适宜于久病体虚者和小儿体虚者进补，药效持久，补而不腻[1]。李云志等[2-3]采用HPLC-ESI-TOF/MS快速分离鉴别了野生祁白术的化学成分，表明野生祁白术与栽培白术具有不同的药效物质基础。祁白术的道地性及优良品质可能与当地地质、气候、土壤、生物等生态环境因素作用有关[4-5]。白术含有挥发油、多糖、黄酮类、内酯类化合物、苷类等生物活性成分[6-8]，具有抑菌[9]、抗肿瘤[9]、抗炎症[10]、调节脂质代谢[11]及改善学习记忆、延缓衰老[12]等功效。本课题组前期研究了祁白术的营养成分及多糖提取工艺，表明祁白术除可作为药用外，还能应用于功能性食品的开发[13-14]。目前国内外学者对于白术化学成分及功效的研究都是基于栽培白术[7,9,11-12]，对祁白术不同极性萃取相抗氧化和抑菌作用的研究仍然缺乏，主要活性成分的分析与鉴定尚未见报道。

本试验拟对祁白术醇提物及其不同极性萃取相的总酚、总黄酮含量及抗氧化、抑菌活性进行研究，考察总酚、总黄酮含量与抗氧化活性的相关性，并采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析醇提物中的主要化学成分，旨在阐明道地药材——祁白术的药效物质基础，同时为祁白术资源在食品、药品领域的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

祁白术：2017年8月于安徽省祁门县古溪乡采集，经除杂、清洗后，将60 ℃烘干至恒重的祁白术粉碎成粉末，过80目筛，干燥保存。

2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、单宁酸(tannic acid, TA)、槲皮素(quercetin, QE)、抗坏血酸(Vitamin C, Vc)、对羟基苯甲酸丙酯(propylparaben, PP)：分析纯，美国Sigma-Aldrich公司；

营养琼脂培养基：生物试剂，北京陆桥技术有限责任公司；

所有分离用有机溶剂：分析纯，南京化学试剂有限公司；

大肠杆菌(E.coli, G-)、绿脓杆菌(P.aeruginosa, G-)、金黄色葡萄球菌(S.aureus, G+)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis, G+)：武汉大学微生物保藏中心。

1.1.2 主要仪器设备

生化培养箱：SPX-100A型，上海仙象仪器仪表有限公司；

超净工作台：DL-CJ-1N型，北京东联哈尔仪器制造有限公司；

立式压力蒸汽灭菌器：LDZF-75KB-III型，上海申安医疗器械厂；

全波长酶标仪：SpectraMax-190型，美国Molecular Devices公司；

气相色谱—质谱联用仪：Agilent HP7890-5975C型，美国Agilent公司。

1.2 试验方法

1.2.1 祁白术甲醇粗提物及各萃取相的制备 取祁白术粉末20 g，按照料液比1∶10 (g/mL)与甲醇溶液混合，60 ℃恒温回流提取3 h，过滤后收集上清液，剩余残渣再按照上述条件提取2次，合并3次上清液，旋转蒸发浓缩得祁白术甲醇粗提物5.51 g。将甲醇粗提物混悬于蒸馏水中，按1∶1体积比依次加入正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，每相萃取3次，分别得到正己烷相0.74 g、二氯甲烷相0.29 g、乙酸乙酯相0.11 g、正丁醇相0.76 g 以及剩余的水相3.47 g。按式(1)计算祁白术各萃取相的提取率。

(1)

式中：

R——提取率，%；

Wf——各萃取相的提取量，g；

We——甲醇粗提物的提取量，5.51 g。

1.2.2 总酚含量测定 采用福林酚法[15-16]。以标准品单宁酸浓度C为横坐标，吸光值Y为纵坐标，绘制标准曲线方程Y=0.002 2C+0.003 4，R2=0.999。单宁酸在50～250 μg/mL时与吸光度呈良好线性关系。根据上述标准曲线计算祁白术甲醇粗提物及各萃取相中的总酚含量，结果以每克样品中含有相当单宁酸毫克数表示，即mg TA/g。

1.2.3 总黄酮含量测定 采用铝盐显色法[17]。以标准品槲皮素浓度C为横坐标，吸光值Y为纵坐标，绘制标准曲线方程Y=0.025 9C-0.015 7，线性范围20～100 μg/mL，R2=0.996。根据上述标准曲线计算祁白术甲醇粗提物及各萃取相中的总黄酮含量，结果以每克样品中含有相当槲皮素毫克数表示，即mg QE/g。

1.2.4 抗氧化活性测定

(1) 还原能力：参考文献[18]。以VC为参照，绘制吸光值Y-质量浓度C的标准曲线，得Y= 5.441C+0.200(R2=0.991)，根据标准曲线，计算祁白术甲醇粗提物及各萃取相的还原能力，计算结果以mg VC/g表示。

(2) ABTS自由基清除能力：参考文献[19]。以VC为标准品，得到吸光值(Y)与VC质量浓度(C)的标准曲线Y=798.8C+11.74(R2=0.997)，根据标准曲线，计算样品对ABTS自由基的清除效果，计算结果以mg VC/g表示。

(3) DPPH自由基清除能力：参考文献[20～21]。以VC为参照，制作吸光值Y-质量浓度C的标准曲线，得Y=905.7C+6.485(R2=0.990)，根据标准曲线，计算样品对DPPH自由基的清除效果，计算结果以mg VC/g表示。

1.2.5 抑菌活性测定 将祁白术甲醇粗提物及各萃取相用二甲基亚砜配置成10.0 mg/mL溶液，将正己烷相配置成1.0，5.0，10.0，15.0，20.0 mg/mL不同浓度的溶液。采用滤纸片扩散法测定[22]祁白术甲醇粗提物及各萃取相对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和绿脓杆菌的抑菌圈直径。正已烷相最小抑菌浓度的测定参考文献[23～24]。以二甲基亚砜为空白对照组(CK)，以对羟基苯甲酸丙酯为阳性对照组(PP)。

1.2.6 祁白术甲醇粗提物化学成分的GC-MS分析 色谱条件：色谱柱为HP-5MS(5% Phenyl Methyl Silox，30 m×0.25 mm×0.25 μm)的石英毛细管柱；无分流进样，进样量为0.5 μL；色谱柱初始温度为40 ℃(保持3 min)，以4 ℃/min升至160 ℃(保持3 min)，以6 ℃/min升至285 ℃(保持10 min)。质谱条件：离子源为EI源，电子轰击能量为70 eV，离子源温度为230 ℃；扫描范围m/z为35～450 amu全离子扫描。通过与NIST08标准谱库的质谱图作对比，确定待测成分。

1.3 统计学分析

运用SPSS 18.0软件对试验结果进行分析。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)中的Duncan’s多重比较法分析数据间的显著差异，P<0.05表示差异显著；采用Pearson’s法分析总酚、总黄酮含量与抗氧化活性之间的相关性。所有试验重复3次，结果表示为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 总酚、总黄酮含量分析

由表1可知，祁白术不同极性萃取相的提取率差异显著，其中水相、正丁醇相及正己烷相的提取率较高，分别为62.98%，13.79%，13.43%。祁白术甲醇粗提物及各萃取相均含有总酚和总黄酮等有效成分，其中总酚含量较多(28.77～139.45 mg TA/g)，而总黄酮含量较少(2.06～21.28 mg QE/g)。不同溶剂对总酚含量影响的变化趋势为乙酸乙酯相>二氯甲烷相>正丁醇相>甲醇粗提物>正己烷相>水相，各萃取相均有显著性差异(P<0.05)。乙酸乙酯相的总酚含量最高，为(139.45±0.19) mg TA/g，其次为二氯甲烷相。乙酸乙酯相从甲醇粗提物中分离的总黄酮高达(21.28±2.28) mg QE/g，是含量最少的水相[(2.06±0.27) mg QE/g]的10.33倍。

表1祁白术不同极性萃取相的提取率及总酚、

总黄酮含量†

Table 1 The extraction yields, contents of total phenolics and total flavonoids of different polarity fractions of Qi Baizhu

样品提取率/%总酚含量/(mgTA·g-1)总黄酮含量/(mgQE·g-1)甲醇粗提物27.5547.48±1.70d4.87±1.54b正己烷相 13.4344.11±2.67e4.39±0.16b二氯甲烷相5.2698.20±0.22b6.57±1.26b乙酸乙酯相2.00139.45±0.19a21.28±2.28a正丁醇相 13.7968.93±0.74c5.52±0.82b水相 62.9828.77±0.39f2.06±0.27b

† 同列不同上标字母表示在统计学上具有显著差异(P<0.05)。

2.2 抗氧化活性分析

由表2可知，祁白术甲醇粗提物及不同极性萃取相的还原能力、对ABTS和DPPH自由基清除能力均呈显著性差异(P<0.05)。乙酸乙酯相、正丁醇相及二氯甲烷相的还原能力较强，分别为(38.95±1.66)，(14.48±0.58)，(14.03±0.03) mg VC/g。ABTS自由基清除能力排序为乙酸乙酯相>二氯甲烷相>正丁醇相>正己烷相>甲醇相>水相，分别为(302.42±7.51)，(249.63±6.37)，(118.66±2.86)，(75.47±1.44)，(72.25±2.45)，(21.10±0.07) mg VC/g。各萃取相对DPPH自由基具有较强的清除能力且差异显著(P<0.05)，其中乙酸乙酯相清除能力最强 [(51.61±2.59) mg VC/g]，其次为二氯甲烷相。结果表明，祁白术各萃取相的还原能力、对ABTS和DPPH自由基清除能力的变化规律具有较好的一致性，其中乙酸乙酯相的抗氧化活性最强。

表2 祁白术不同极性萃取相的抗氧化活性†Table 2 Antioxidant activity of different polarity fractions of Qi Baizhu mg VC/g

† 同列不同上标字母表示在统计学上具有显著差异(P<0.05)。

2.3 总酚、总黄酮含量与抗氧化活性的相关性分析

由表3可知，还原能力与ABTS自由基清除能力、DPPH自由基清除能力均呈显著相关(P<0.05)，相关系数R分别为0.875，0.874。ABTS自由基清除能力与DPPH自由基清除能力呈极显著相关(P<0.01)，相关系数R为0.955。表明3种抗氧化活性检测方法较好地反映了祁白术甲醇粗提物及不同极性萃取相的抗氧化作用。

祁白术的总酚含量与总黄酮含量之间呈显著相关，相关系数R为0.907。各萃取相的总酚含量与还原能力、ABTS自由基清除能力及DPPH自由基清除能力均呈极显著相关(P<0.01)，相关系数R分别为0.949，0.982，0.956。总黄酮含量与还原能力、ABTS自由基清除能力及DPPH自由基清除能力均呈显著相关，相关系数R分别为0.967，0.831，0.879。这些结果表明，总酚、总黄酮是祁白术中的主要抗氧化活性成分。目前很多研究[25-26]表明，许多植物中的总酚、总黄酮含量与抗氧化能力之间存在良好的相关性，与本试验结果相似。

2.4 抑菌活性分析

由表4可知，祁白术的甲醇粗提物、正己烷相、二氯甲烷相及阳性对照(PP)对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和绿脓杆菌均有不同程度的抑制作用；乙酸乙酯相和正丁醇相对大肠杆菌、绿脓杆菌有一定的抑制作用，但对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌无明显抑制效果；水相则对4种受试菌均无显著抑制作用。其中正己烷相的抑菌活性最显著(P<0.05)，在10 mg/mL浓度下，对受试菌的抑菌圈直径分别为大肠杆菌(10.38±0.85) mm，金黄色葡萄球菌(10.13±0.48) mm，枯草芽孢杆菌(9.63±0.25) mm，绿脓杆菌(10.25±0.50) mm。

本试验进一步测定了祁白术活性部位正己烷相不同浓度条件下对4种受试菌的抑制作用。由表5得知，空白对照组(CK)无抑菌作用，而正己烷相在不同浓度条件下对4种受试菌均具有不同程度的抑制效果，且随着浓度的增大，抑制作用逐渐增强。正己烷相对4种受试菌的最小抑菌浓度均为1 mg/mL，但在各个浓度条件下，对大肠杆菌和绿脓杆菌的抑制活性强于同等浓度条件下对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的，表明正己烷相对革兰氏阴性细菌的抑制效果优于革兰氏阳性细菌。

2.5 甲醇粗提物化学成分的GC-MS分析

对甲醇粗提物化学成分进行了GC-MS定性分析，得到总离子流图，结果见图1。通过与NIST08标准谱库的质谱图作对比，鉴定出18种化合物，占总峰面积量的91.24%，包

表3 祁白术的总酚、总黄酮含量与抗氧化活性的相关性分析†Table 3 Correlation analysis between total phenolic, flavonoid contents and antioxidant activity of Qi Baizhu

† *代表显著相关性(P<0.05)；**代表极显著相关性(P<0.01)。

表4 祁白术不同极性萃取物对4种菌的抑菌圈直径†Table 4 Diameter of inhibitory zone of different polarity fractions of Qi Baizhu against four common bacterial strains mm

† 萃取物浓度为10 mg/mL，PP浓度为1 mg/mL；同列不同上标字母表示在统计学上具有显著差异(P<0.05)。

表5 祁白术正己烷相对4种菌的抑菌圈直径†Table 5 Diameter of inhibitory zone of hexane fraction from Qi Baizhu against four common bacterial strains mm

† 同列不同字母表示在统计学上具有显著差异(P<0.05)。

括3种酚类(35.02%)、2种醇类(28.63%)、9种烯类(15.42%)、3种酮类(8.99%)、1种酯类(3.18%)化合物。由表6可知，甲醇粗提物的主要化学成分为3,3'-二氨基-4,4'-二羟基联苯(33.47%)、β-桉叶醇(28.33%)、β-愈创木烯(5.91%)、3,3,5,6,7-五甲基-1-茚满酮(4.70%)、癸二酸二异辛酯(3.18%)、γ-榄香烯(3.11%)等。

图1 祁白术甲醇粗提物的GC-MS总离子流图Figure 1 Total ion chromatogram of methanol crude extract of Qi Baizhu表6 祁白术甲醇粗提物的化学成分及其相对含量

Table 6 Chemical constituents and relative contents of methanol crude extract of Qi Baizhu

序号保留时间/min化合物相对含量/%127.7484(-)-异丁香烯0.54228.0546γ-榄香烯3.11328.8951α-石竹烯0.22429.8654β-荜澄茄烯0.56529.9536α-芹子烯0.68630.61782,4-二叔丁基苯酚0.36731.4013(+)-巴伦西亚橘烯1.95834.2861(+)-香橙烯1.31934.6182β-愈创木烯5.911035.2097β-桉叶醇28.331135.33943,3'-二氨基-4,4'-二羟基联苯33.471235.5781长叶烯1.141337.2437桉油烯醇0.301437.9286桔利酮1.301542.57243,3,5,6,7-五甲基-1-茚满酮4.701644.61151',8'-二羟基-3',6'-二甲基-2'-萘乙酮2.991748.30062-(3,7-二甲基-2,6-二辛烯基-4-甲氧基苯酚1.191855.8812癸二酸二异辛酯3.18

3 结论

经过试验可知，祁白术乙酸乙酯相中的总酚、总黄酮含量最高，且表现出最强的抗氧化活性。相关性分析表明，总酚、总黄酮含量与还原能力和对ABTS、DPPH自由基清除能力均呈显著正相关，说明总酚、总黄酮是祁白术中的主要抗氧化活性成分。体外抑菌试验显示，正己烷相对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和绿脓杆菌的抑制作用最显著。经GC-MS分析甲醇粗提物中的主要化学成分，共18种化合物，以酚、醇、烯类化合物为主，其中高含量的酚类、醇类、烯类化合物可能是潜在的抑菌活性成分。本研究阐明了道地药材祁白术的药效物质基础，为祁白术资源的综合开发与利用提供了理论依据。下一步将对祁白术活性部位的分离纯化做进一步的分析，以明确祁白术抗氧化和抑菌作用的主要组分。

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