生物活性陶瓷、骨形态发生蛋白、医用生物蛋白胶复合物诱导成骨活性研究

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山东省济宁市第二人民医院骨科,济宁 272049

随着创伤性骨缺损及各种骨病刮除病灶后遗留骨缺损的日益增多,骨缺损的修复重建成为骨科常见的课题,也是难题之一。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)能够诱导动物或人体间充质细胞分化为骨、软骨、韧带、肌腱和神经组织[1]。本研究用陶瓷人工骨、纤维蛋白和骨形态发生蛋白复合物进行诱导成骨试验,通过大体标本、病理组织学观察及碱性磷酸酶活性检测,与单纯使用陶瓷人工骨进行对比,以探讨复合载体复合诱导因子的诱导成骨作用是否优越及其作用机制。

1 材料和方法

1.1 病例选择、分组

选纯种SD大鼠20只,雌雄不限,体质量(200±20)g,随机分为A、B、C 3组,每组10只,观察4周。每组10只分为2组,每组5只,第1组(试验组)、第2组(对照组)。

1.2 复合物制备

将骨形态发生蛋白溶液、纤维蛋白原溶液、陶瓷人工骨按1∶1∶1比例放入玻璃容器,搅拌,充分混合后,置于37 ℃恒温箱中保温1 h,充分反应,即得陶瓷人工骨、骨形态发生蛋白及纤维蛋白复合物。

1.3 手术过程

大鼠用0.25%硫贲妥钠腹腔注射麻醉,将双腿剃毛,酒精消毒,切开股后肌群,分离出肌袋,按表1分别植入相应复合物,缝合各层,放入笼中饲养。

1.4 术后处理

每只大鼠每日肌注青霉素4万单位,连注3 d,4周检测。

1.5 大体标本肉眼观察植入物的大小、硬度、血管分布情况

各组动物于相应时间点用脱臼法处死,观察植入物的大小、硬度、血管分布情况。测量并记录植入物的直径,记录血管长入情况,并记录硬度。

1.6 术后植入物组织学观察

在设定的时间点处死动物,取出标本,每组5个标本用10%甲醛中性液固定,常规脱钙、脱水、石蜡包埋,5 μm连续切片,苏木精-伊红(HE)染色,光镜下观察。

1.7 术后植入物碱性磷酸酶活性测定

每组取5个标本,称量湿重,加入1 mL生理盐水,用电动匀浆机进行匀浆,4 000 r/min,15分钟离心后去上清液,用ALP试剂盒在Olympus AU800全自动生化分析机上进行活性检测,其结果除以湿重,即得ALP含量(U/g)。

1.8 数据处理

数据整理后采用SPSS 12.0统计软件。组间比较采用t检验,计数资料采用χ2检验分析方法进行统计分析。

2 实验结果

2.1 大体标本肉眼观察植入物的大小、硬度、血管分布情况

植入陶瓷人工骨、纤维蛋白和骨形态发生蛋白复合物(A)及陶瓷人工骨(B)大体标本肉眼观察植入物的大小、硬度、血管分布结果,有效组植入物直径均超过3 mm,有大量骨样组织沉积,质地较硬,并可见大量血管长入,数据见表1。

2.2 术后植入物组织学观察

光镜下标本组织学观察,植入陶瓷人工骨、纤维蛋白和骨形态发生蛋白复合物(A)及陶瓷人工骨(B)标本组织学观察数据,有效组移植物内有大量骨细胞出现,无效组移植物内软骨细胞、类骨质较多,骨细胞较少,结果见表2,图1～3。

表1 大鼠植入物大小、硬度、血管分布情况数据统计Tab.1 Size, hardness, and vascularity of implantation materials in rats

表2 各组大鼠植入物的组织生长情况Tab.2 Tissue growth of implantation materials in rats of each group

A:1周;B,C:2周

2.3 术后植入物碱性磷酸酶活性测定

植入陶瓷人工骨、纤维蛋白和骨形态发生蛋白复合物(A)及陶瓷人工骨(B)标本碱性磷酸酶活性测定数据见表3。

3 讨论

骨病和创伤引起的骨缺损或功能障碍是危害人类健康的主要原因之一[1-4]。目前,各种骨缺损最行之有效的治疗方法为骨移植。

3.1 骨移植修复理论

骨移植修复目前主流理论有5个概念:(1)直接愈合;(2)混合愈合;(3)爬行替代;(4) 传导成骨;(5)诱导成骨[5]。Taylor等[6]1975年首次将血管化自体骨移植应用于临床并取得成功。研究发现,包括转化生长因子在内的多种生长因子均参与骨修复过程[7-8]。

3.2 陶瓷人工骨、纤维蛋白和骨形态发生蛋白复合物的骨诱导作用

生物陶瓷具有优良的生物相容性能和临床应用价值。研究发现,孔径大于100 μm的多孔陶瓷才能为组织内生长增殖提供必要营养[9]。由此可见,材料的生物学特性受孔径尺寸与形状的直接影响。同时,人骨结构与成分是介于磷石和磷酸钙之间的物质。陶瓷人工骨无论是成分还是结构都与人骨相似。

BMP是一种生长分化因子,可诱导成骨修复骨缺损,诱导间质细胞分化为骨或软骨[10]。Simank等[11]建立羊股骨头坏死模型,将含BMP-2的血凝块植入坏死区域,结果发现实验组与单纯植入血凝块组相比,有明显的骨形成。

医用生物蛋白胶(纤维蛋白封闭剂)是从血液中提取相关成分(纤维蛋白原、ⅩⅢ因子、凝血酶等),模拟人体凝血机制的最后阶段,最终形成乳白色凝胶物。Bosch等[12]在动物实验中发现覆盖纤维蛋白胶的骨皮质缺损,其毛细血管和结缔组织以较快速度生长。骨形态发生蛋白制成骨修复材料保证骨形态发生蛋白稳定性,提高其诱导成骨能力[13]。

3.3 陶瓷人工骨、纤维蛋白和骨形态发生蛋白复合物在治疗骨缺损的应用

长期以来,骨缺损修复一直是骨科临床亟待解决的难题。目前,骨移植为解决这一难题带来希望,修复效果显著,但移植骨材料来源有限、存在二次手术创伤、术后易出现感染、免疫排斥反应等问题。大量实验研究已证实BMP具有诱导骨形成和促进骨缺损修复的作用,故将BMP应用于临床治疗骨缺损已提上日程。骨移植为解决这一难题带来希望,修复效果显著,但具有一定局限性[14]。BMP移植需要有适宜载体才能发挥作用。有研究表明,丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石生物支架可持续缓慢释放骨形态发生蛋白[15-16]。 Ruhe等[17]将BMP/磷酸钙骨水泥、磷酸钙骨水泥、BMP/胶原海绵分别植入兔颅骨骨缺损区,观察到BMP/磷酸钙骨水泥组在机械强度、骨传导性和新骨形成方面的效果明显优于其他两组。李建军等[18]将转染BMP-2基因的骨髓基质干细胞(MSC)与聚乳酸/聚己内酯(PLA/PCL)支架复合以修复兔桡骨缺损,取得预期效果。

表3 大鼠组织碱性磷酸酶活性Tab.3 Alkaline phosphatase activities in rats

陶瓷人工骨可发挥支架及骨传导作用,纤维蛋白作为生物黏合剂,可将BMP黏合于陶瓷人工骨,作为复合载体,发挥双重诱导作用,效果显著,因此该复合物是较为理想的骨移植修复材料。

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