皖南蝮蛇抑瘤组分Ⅰ对人胃癌SGC-7901细胞作用机制的初步探讨

赵 容，卢林明，张根葆，柴 琳，周 珏

(皖南医学院 1.病理生理学教研室；2.病理学教研室；3.口腔医学院，安徽 芜湖 241002)

胃癌是全球常见肿瘤之一，占全世界病死率的第二位[1]，我国胃癌发病率占全球的42.7%,且我国胃癌的发病率及病死率均占所有恶性肿瘤的前三位[2]。由于胃癌早期症状往往并不明显，大多患者就诊时已是胃癌晚期，失去了手术机会，所以寻求新一代天然安全高效的抗肿瘤药物成为我们进一步延长患者生命、提高患者生存质量的重要课题[3-4]。蛇毒是由蛇的毒腺分泌的一种天然毒蛋白，成分复杂，主要含蛋白质、多肽及一些酶类，具有广泛的生物学活性，可作为天然的药用资源。蛇毒可导致神经和细胞毒性，水肿，血小板减少症和血液凝固因子的损害，并存在可以损害细胞完整性的l-氨基酸氧化酶和解联蛋白，国内外实验表明,蛇毒对多种肿瘤等都有较好的抑制作用[5-8]。皖南蝮蛇毒抑瘤组分Ⅰ(Agkistrodonhalysvenom antitumor component-Ⅰ,AHVAC-Ⅰ)是由皖南医学院蛇毒研究所通过改良蛇毒分离纯化技术，从皖南产蝮蛇蛇毒中提取的一种抑瘤组分，前期课题组发现AHVAC-Ⅰ对胃癌细胞株的作用机制可能通过诱导凋亡来抑制肿瘤细胞生长增殖[8],因线粒体凋亡途径是重要的凋亡方式之一，故本实验选择探讨线粒体凋亡途径在AHVAC-Ⅰ对胃癌细胞株的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 人胃癌细胞SGC-7901的体外培养 试剂及药品： AHVAC-Ⅰ干冻粉由皖南医学院蛇毒研究所提供。RPMI 1640细胞培养基(凯基生物Hyclone)、胎牛血清(杭州四季青公司)、青霉素-链霉素溶液、胰酶消化液、MTT试剂盒(美国Sigma公司)、JC-1线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，△Ψm)(碧云天生物技术公司)。RPMI培养基与胎牛血清按9∶1的比例配制细胞培养液(按双抗说明书建议比例滴加双抗)，4℃冰箱保存备用，使用前于37℃复温。细胞株常规培养，胰酶消化1∶2传代，置于5%CO2、37℃的培养箱中孵育，每隔1～2 d换液、传代，至对数增长期，收集细胞实验。

1.2 MTT法筛选AHVAC-Ⅰ对人胃癌细胞SGC-7901增殖的影响 选择传代培养第3～5代生长速度快、形态好的SGC-7901细胞常规消化，调整细胞密度为1×104个/mL，按每孔200 μL的量均匀接种于96孔板中，培养箱孵育过夜。将AHVAC-Ⅰ干冻粉溶解于培养液中，稀释、配制成各浓度 AHVAC-Ⅰ(3、5、10、20、30 mg/L)，设空白对照组、正常对照组，每孔设5复孔。培养箱内孵育24 h后各孔中加入10 μL MTT溶液，继续培养4 h，轻轻吸掉上清液，向每孔中加入150 μL DMSO，在水平振荡仪上避光振荡10 min，酶标仪在波长490 nm处进行检测。计算AHVAC-Ⅰ各个浓度作用24 h对细胞的增殖抑制率(inhibition ratio,IR)，计算公式：IR=[1-(实验组OD值-调零孔OD值)/(对照孔OD值-调零孔OD值)]×100%。

1.3 JC-1检测△Ψm改变 设置正常对照组，3、10、20 mg/L AHVAC-Ⅰ培养箱内孵育6 h。按JC-1说明书加入JC-1工作液37℃避光孵育20 min，洗净。多功能酶标仪设置检测单体时激发光为490 nm,发射光为530 nm；检测聚合物时激发光为525 nm,发射光为590 nm。计算红光/绿光的荧光强度变化。

2 结果

2.1 MTT 如图1、表1示，在24 h时实验组随AHVAC-Ⅰ浓度的增加(3～30 mg/L)细胞增殖抑制率逐渐增加(P<0.05)，差异有统计学意义。20 mg/L组与30 mg/L组对SGC-7901细胞的增殖抑制差异无统计学意义(P>0.05)，其他组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，故选择3、10、20 mg/L作为实验浓度。

AHVAC-Ⅰ/(mg/L)24hOD值IR/%空白组0.155±0.013-正常对照组0.547±0.044a-30.463±0.006b0.15250.403±0.022c0.263100.315±0.010d0.423200.202±0.034e0.630300.163±0.022e0.701F162.463-P0.000-

注：字母不同代表组间差异有统计学意义(P<0.05),字母相同代表组间差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 AHVAC-Ⅰ对SGC-7901细胞增殖抑制的影响

2.2 显微镜下细胞形态改变 正常对照组细胞贴壁生长，且贴壁较为紧密，形态为不规则多边形，核分裂像较多。经AHVAC-Ⅰ处理24 h后，倒置显微镜下观察到随浓度增加细胞密度逐渐稀疏，细胞悬浮、固缩等凋亡现象逐渐增加。低浓度组的形态基本是多边形，但可以看见细胞边缘变亮，细胞的贴壁率有所下降；中浓度时可见细胞固缩变圆，体积缩小，细胞间隙变大，出现凋亡小体；而高浓度组可见细胞抱团体呈现小、圆、亮的特征，可见较多的凋亡小体。详见图2。

A:正常对照组;B:5 mg/L组;C:10 mg/L组;D:20 mg/L。

图2 AHVAC-Ⅰ处理24 h后SGC-7901细胞形态变化(×400)

2.3 AHVAC-Ⅰ处理6 h后SGC-7901细胞△Ψm变化 酶标仪检测分析低、中、高浓度组JC-1聚合物/JC-1单体依次是 (0.713±0.044)、(0.492±0.082)、(0.374±0.033)，可以看出与对照组(1±0.075)比较，AHVAC-Ⅰ处理6 h后实验组的△Ψm均降低(P<0.01)，随AHVAC-Ⅰ浓度的增加(3～20 mg/L)△Ψm逐渐下降，差异有统计学意义(F=71.29,P<0.05)。详见图3。

AHVAC-Ⅰ不同浓度组与对照组比较P<0.01；字母不同代表组间比较P<0.05。

图3 AHVAC-Ⅰ处理6 h后SGC 7901细胞△Ψm变化

3 讨论

细胞凋亡是细胞程序死亡的方式，目前主要有三条已知的途径，即死亡受体途径，线粒体凋亡途径以及内质网凋亡途径，而早在20世纪90年代中期，线粒体在凋亡途径中的中心地位就得到了认可[9]。△Ψm的改变是线粒体凋亡途径的早期事件，检测△Ψm的变化可以反映PTP孔开放的情况。△Ψm的下降反映PTP孔的异常开放，PTP孔的异常开放引起线粒体促凋亡蛋白(如Cyt-c、AIF等)释放，激活Caspase-9酶的活性形成的凋亡复合体，进一步激活有死亡蛋白酶称号的Caspase-3，从而引起细胞凋亡[10-11]。JC-1是一种广泛用于检测△Ψm的理想荧光探针，本实验选用JC-1检测试剂盒检测AHVAC-Ⅰ对SGC-7901细胞△Ψm的影响，发现随着AHVAC-Ⅰ浓度的增加(3～20 mg/L),细胞形态学呈明显的凋亡特征，△Ψm从(0.713±0.044)下降到(0.374±0.033)，说明AHVAC-Ⅰ对SGC-7901的促凋亡作用与△Ψm的下降呈正相关。而此线粒体凋亡途径的具体机制以及是否还有其他凋亡途径的参与尚需要进一步的研究探讨。

【参考文献】

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