UCA1和miR-141在膀胱癌细胞系和膀胱癌组织中的表达及与临床预后的相关性

刘咏松，刘聪颖，陈孝斌

(宜宾市第二人民医院泌尿外科，四川宜宾 644000)

膀胱癌(bladder cancer)属于泌尿系统恶性肿瘤，发病率位居恶性肿瘤发病率第九[1]。可按照病理类型划分为膀胱尿路上皮癌、鳞状细胞癌、腺癌、透明细胞癌、小细胞癌、类癌[2]。其中，膀胱尿路上皮癌是最为常见的膀胱癌病理类型，约占90%以上[3]。膀胱癌的诊断目前还主要依赖于膀胱镜检查，但其在检查过程中会对患者造成创伤，因此寻找新的诊断方法成为迫切需要。目前，尽管采用切除手术联合化疗对膀胱癌患者进行治疗，然而由于膀胱癌易复发，发生侵袭和转移，患者生存率仍然很低[4]。因此阻止癌症发生侵袭和转移成为治疗膀胱癌的关键。肿瘤发生发展受多因素调节，除蛋白外，还有大量非编码蛋白的RNA参与调节此过程。本研究拟探讨尿路上皮癌抗原1(urothelial cancer associated1，UCA1)和miR-141在膀胱癌细胞和膀胱尿路上皮癌组织中的表达及与临床预后的相关性，以期为膀胱癌的诊断与治疗奠定数据基础。

1 材料与方法

1.1组织标本收集宜宾市第二人民医院2013年1月至2015年3月间收治患者的膀胱尿路上皮癌组织标本73例，其中男性患者62例，女性患者11例；年龄35～80岁，平均年龄(51.27±2.36)岁。选取标本患者经完整病例报告确认，术前未接受放疗和化疗。参照WHO标准进行病理分级：G1级22例、G2级34例、G3级17例；参照国际抗癌联盟(union for international cancer control，UICC)标准进行临床分期：T1期31例、T2期18例、T3期19例、T4期5例。另取，20例癌旁组织作为正常对照，均经病理组织学确认为正常组织。实验选取标本均经所属患者同意及宜宾市第二人民医院伦理委员会批准。自手术切除后，对患者分别进行为期2年的随访，其中存活33例，死亡40例。

1.2细胞株人膀胱尿路上皮癌细胞系：T24购自上海中乔新舟生物科技有限公司；UM-UC-3购自上海晶抗生物工程有限公司；BIU-87购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司。人膀胱尿道正常细胞系：膀胱上皮细胞系(bladder epithelial cells，BEC)购自上海泽叶生物科技有限公司；人膀胱平滑肌细胞系(human bladder smooth muscle cells，HBd SMC)购自上海晶抗生物工程有限公司；尿道上皮细胞系(human urethral epithelial cells，HUEC)购自上海钰博生物科技有限公司。

1.3主要试剂与仪器Trizol购自北京华迈科技生物技术有限责任公司；StarSpin Small RNA Kit购自上海康朗生物科技有限公司；LnRcute lncRNA cDNA购自天根生化科技(北京)有限公司；miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit购自北京百奥莱博科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR Primix Ex TaqTM购自宝生物工程(大连)有限公司；UCA1和miR-141引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成；Nanodrop 2000购自赛默飞世尔科技中国有限公司；荧光定量PCR仪购自艾本德中国有限公司。

1.4实时荧光定量聚合酶链反应利用Trizol法和StarSpin Small RNA Kit分别提取组织或细胞的总核糖核酸(total RNA)和小分子核糖核酸(small RNA)，具体方法参照试剂盒说明书。Nanodrop 2000检测总RNA质量，1.8

表1引物序列

引物名称引物序列UCA1⁃正向引物5′⁃CTAGACCGGTTTCTCCTCATTC⁃3′UCA1⁃反向引物5′⁃GCGTGATTGGCGGTCAAAAGAG⁃3′miR⁃141⁃正向引物5′⁃CTCAAGGCAACCTACCGAAAAG⁃3′miR⁃141⁃正向引物5′⁃TATCGGACCCATCACGGAGTGG⁃3＇β⁃actin⁃正向引物5′⁃CAGGGCGTGATGGTGGGCA⁃3′β⁃actin⁃反向引物5′⁃GCTGTCAACCGTTCCAGGTCG⁃3′U6⁃正向引物5′⁃GATTAGAACCGTCGGTAACGGAA⁃3′U6⁃反向引物5′⁃AGCGATCTCGTTGGCCTTTCTACC⁃3′

2 结 果

2.1UCA1和miR-141在膀胱癌细胞中的表达 以BEC为对照组，检测其余细胞系中UCA1和miR-141相对表达量。与BEC比较，UM-UC-3、BIU-87及T24中的UCA1和miR-141相对表达量显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。非膀胱癌细胞HUC和HBdSMC中UCA1和miR-141相对表达量相较于BEC无显著性差异(P<0.05，表2) 。

表2UCA1和miR-141在细胞中的表达

细胞UCA1miR⁃141 BEC1．01±0．110．99±0．12UM⁃UC⁃313．02±1．67∗9．63±1．24∗BIU⁃878．89±1．29∗7．38±0．79∗T2410．03±2．11∗8．21±1．36∗HUEC1．13±0．271．03±0．26HBdSMC0．97±0．181．15±0．29

与BEC相比，*P<0.05。

2.2UCA1和miR-141在膀胱癌组织中的表达膀胱尿路上皮癌组织中UCA1表达水平较正常癌旁组织明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。膀胱尿路上皮癌组织中miR-141表达水平较正常癌旁组织明显升高(P<0.05，表3)。

2.3膀胱尿路上皮癌组织中UCA1、miR-141表达与临床参数的关系以UCA1或miR-141相对表达量2-△△ct≥1为高表达，记为阳性。在膀胱尿路上皮癌组织标本中，UCA1阳性表达57例，miR-141阳性表达64例。UCA1、miR-141的表达同膀胱尿路上皮癌患者年龄、性别无显著相关性(P>0.05)。UCA1的表达与病理分级、临床分期及肿瘤转移均具有显著相关性(P<0.05)。miR-141的表达与临床分期及肿瘤转移均具有显著相关性(P<0.05，表4)。

表3UCA1和miR-141在膀胱癌组织中的相对表达量

组织例数(n)UCA1miR⁃141膀胱尿路上皮癌组织7317．39±0．1611．62±0．67正常癌旁组织201．02±0．011．03±0．28t值455．50668．838P值0．0000．000

表4膀胱尿路上皮癌组织中UCA1、miR-141的表达与临床参数的关系

(例)

2.4影响膀胱尿路上皮癌患者生存率的因素自膀胱尿路上皮癌患者进行切除手术开始，分别对73例患者进行随访，至2017年3月截止。73例患者中，存活患者33例，死亡患者40例，生存率为45.20%。膀胱尿路上皮癌患者生存率与患者的性别、年龄及病理分级之间无明显相关性(P>0.05)。膀胱尿路上皮癌临床分期T1～T2生存率为67.35%，显著低于T3～T4期患者生存率(P<0.05)。UCA1高表达患者生存率为31.58%，显著低于低表达患者(93.75%)(P<0.05)。miR-141高表达患者生存率为39.06%，显著低于低表达患者(88.89%)(P<0.05)。见表5。

2.5影响膀胱尿路上皮癌患者生存率的Cox回归分析Cox回归分析显示，影响膀胱尿路上皮癌患者预后的独立危险因素分别有临床分期、肿瘤转移、UCA1和miR-141表达(表6)。

2.6膀胱尿路上皮癌组织中UCA1和miR-141表达的相关性通过进行Spearman秩检验结果显示，膀胱尿路上皮癌组织中UCA1和miR-141表达呈现明显正性相关(r=0.613，P<0.05)。

表5影响膀胱尿路上皮癌患者生存率的因素分析(例)

表6影响膀胱尿路上皮癌患者生存因素的Cox回归分析

指标危险因素95%置信区间P值临床分期11．6721．719～18．7100．001肿瘤转移8．2891．419～11．9020．021UCA1表达2．6411．152～4．8760．014miR⁃141表达1．5611．014～3．6710．025

3 讨 论

膀胱癌受多因素调节，除受DNA突变和蛋白质异常因素影响外，RNA异常也影响着膀胱癌的发生发展[5]。过往对肿瘤的研究主要集中于编码蛋白的基因，随着对肿瘤发病机制研究的深入，国内外专家也逐渐意识到非编码RNA在肿瘤发生发展中发挥着重要的调节作用[6]。相关研究指出，长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)参与调控癌症相关基因，未来有望成为肿瘤临床诊断和治疗的分子靶标[7]。LncRNA是一类非编码RNA，广泛存在于细胞内，其长度超过200核苷酸，参与调控遗传印迹、染色质调控、转录调控等多种生物过程[8〗。研究发现，LncRNA失调与胃癌、非小细胞肺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤的发生发展密切相关[9-11]。随着对LncRNA与肿瘤发病机制研究的深入，发现LncRNA主要通过影响细胞表观修饰、信号转导通路及RNA编辑等方式调控肿瘤，具有肿瘤标志物的潜能[12]。

UCA1属于LncRNA，位于19p13.12基因位点，含有3个外显子和2个内含子[13]。LIU等[14]研究表明，UCA1在膀胱癌组织中呈特异性表达，且表达水平显著高于癌旁正常组织。本研究对膀胱癌细胞及膀胱癌组织中UCA1的表达水平进行检测，结果显示，膀胱癌细胞系中UCA1的表达水平显著高于非膀胱癌细胞系，且膀胱癌组织中UCA1的表达水平亦显著高于正常癌旁组织，与过往研究一致。MILOWICH等[15]通过研究发现肿瘤病理分级越高或临床症状越严重，UCA1的阳性率越高；XUE等[16]研究发现UCA1对膀胱癌的转移和侵袭具有促进作用。因此，为探索UCA1与膀胱癌之间的联系，本研究对UCA1阳性表达与膀胱癌患者的临床参数进行相关性分析，结果显示，膀胱癌组织UCA1阳性表达与病理分级、临床分期及肿瘤转移情况显著相关，进一步分析显示其与患者两年生存率密切相关，提示UCA1阳性表达率的升高与膀胱癌患者预后不良有显著相关性。推测，UCA1可作为膀胱癌诊断及预后预测的分子标志物。

近年来，对微小RNA(MicroRNA,miRNA)在肿瘤中调控机制的研究较为广泛，与LncRNA不同的是miRNA根据靶基因的不同，发挥不同的作用，既可以促进癌症的进程也可以抑制癌症的发生发展，大量研究证实，miR-141在肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移中发挥着至关重要的转录调节作用[17-18]。miR-141属于miR-200家族成员，位于12p 13.31位点。JAARSVELD等[19]针对卵巢癌细胞的研究表明，miR-141可通过NF-κB通路抑制KEAP1表达，增强卵巢癌细胞对顺铂的耐药性。ZHOU等[20]研究表明miR-141在胃癌组织中呈过表达，当下调miR-141表达水平时，胃癌细胞增殖能力明显下调。本研究结果显示膀胱癌细胞系及癌组织中miR-141表达水平较非膀胱癌细胞系及癌旁正常组织显著升高，且膀胱癌组织中miR-141阳性表达与临床分期及肿瘤转移情况与miR-141阳性表达显著相关，两年内生存率相关性分析，提示miR-141阳性表达率的上调与膀胱癌患者预后不良有显著相关性，推测miR-141可能为致癌基因，参与肿瘤转移和侵袭，可作为膀胱癌的潜在分子靶标。

综上所述，本研究结果显示，UCA1、miR-141在膀胱癌细胞和膀胱尿路上皮癌组织中均呈高表达水平，UCA1、miR-141均与膀胱癌患者预后效果密切相关，对患者预后效果具有指示性作用，其中miR-141可能还具有促进癌症发展的作用。本研究对UCA1和miR-141表达相关性进行分析，显示UCA1与miR-141呈正相关性，其具体机制有待更深一步研究。

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切，预后好[4,12]。而本文中病例2考虑到患者年龄较大，对侧肾脏功能差，一期手术切除时结节切除完整，二期手术风险较大，故未行二期手术治疗而予以密切观察，目前随访没有复发证据。

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