发酵液中乙醇含量的测定方法

李岭卓，李 锐，熊小毛，杨团员，张明春，还 萍，马向东

（1.湖北大学生命科学学院，生物资源绿色转化湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430062；2.湖北白云边酒业股份有限公司，湖北 松滋 434200）

在酿酒相关研究和生产中，常涉及乙醇含量的测定。乙醇含量测定的方法主要有气相色谱法、液相色谱法、生物传感器法[1-2]、密度瓶法、酒精计法、重铬酸钾比色法等[3]。这些方法中，密度瓶法、酒精计法需要对样品进行蒸馏，操作较为繁琐；液相色谱法需要用示差折光检测器，一般实验室不具备，或者需对样品进行柱前衍生化[4]，操作也较为复杂；气相色谱法[5]准确度高，但存在仪器昂贵、操作复杂、测定时间长等缺点；生物传感器法操作方便、测定准确，不过存在价格较高、设备不普及等不足。

相比较而言，重铬酸钾比色法操作较简单，能同时测定多个样品，不需要特殊仪器，一般实验室均能进行。其原理：在酸性条件下重铬酸钾与乙醇反应生成三价铬离子（Cr3+），而Cr3+在590 nm[6]处有吸收峰，可以利用吸光度值计算溶液中的乙醇含量。

在发酵液中，除乙醇外还含有其他还原性物质可以与重铬酸钾反应[7]，也会生成Cr3+，使得测定结果偏大。为了排除还原性物质的干扰，本研究用煮沸、补水的方式除去发酵液中的乙醇，将原发酵液和除去乙醇的发酵液都与重铬酸钾反应，得到两个吸光度，则两个吸光度之差（前者减去后者）可以表示乙醇的实际含量。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品：实验中用的哈尔滨小麦王啤酒、波尔多骑士红葡萄酒购于超市；12 h、24 h、48 h的酿酒酵母YPD发酵液实验室自备。

乙醇标准溶液（10 g/L）：分析纯无水乙醇10 g，蒸馏水定容至1 L。

YPD溶液：酵母粉5 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸馏水定容至1 L，108℃灭菌20 min。

重铬酸钾溶液：称取50 g重铬酸钾（分析纯）溶于500 mL水中，加100 mL浓硫酸，冷却，蒸馏水定容至1 L。

仪器设备：SectraMax M2酶标仪，Molecular Devices公司；M-100生物传感器，深圳西尔曼科技有限公司；微波炉；电炉；水浴锅；电子天平等。

1.2 试验方法

1.2.1 重铬酸钾比色法标准曲线

取乙醇标准溶液，用蒸馏水稀释成乙醇浓度分别为0、0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L的样品溶液。在15 mm×15 cm的试管中，分别加入5 mL样品溶液、2 mL蒸馏水和3 mL重铬酸钾溶液，加试管塞，沸水浴10 min，流水冷却至室温，取200 μL反应液至酶标板中，用酶标仪测定其在590 nm处的吸光度。以吸光度为横坐标，乙醇浓度（g/L）为纵坐标，作标准曲线。

1.2.2 煮沸方式与时长的探索

探究微波炉和电炉两种煮沸方式，1 min、2 min、3 min 3个煮沸时长对乙醇残留量的影响。

1.2.3 操作过程

操作流程见图1。发酵液用蒸馏水稀释合适的倍数，使稀释后乙醇浓度在0.2～1.4 g/L之间，得待测液Ⅰ。取10 mL待测液Ⅰ加入50 mL锥形瓶中，称重，记录重量，微波炉或电炉煮沸2 min（沸腾后开始计时），冷却，将锥形瓶放在天平上，补加蒸馏水至原重量，得待测液Ⅱ。

按5 mL待测液+2 mL蒸馏水+3 mL重铬酸钾溶液的体系反应，测吸光度（操作参照1.2.1）。将吸光度Ⅰ与吸光度Ⅱ之差带入线性方程，再乘以稀释倍数，即可以计算出发酵液中的乙醇含量。

图1 操作流程

1.2.4 煮沸对YPD溶液的影响

取YPD溶液，蒸馏水稀释15倍，得YPD待测液。取部分YPD待测液煮沸、补水，将煮沸前的YPD待测液和煮沸、补水后的YPD待测液分别与重铬酸钾反应，测吸光度。

1.2.5 回收率及精密度实验

取2 g无水乙醇，用YPD溶液定容至100 mL。将该溶液用蒸馏水稀释15倍，按1.2.3的方法，测定溶液中乙醇的含量，做6个平行。

1.2.6 发酵液、葡萄酒、啤酒中乙醇浓度的测定

取12 h、24 h、48 h的酿酒酵母YPD发酵液。发酵液均稀释10倍，葡萄酒稀释100倍，啤酒稀释25倍。按1.2.3的方法，测定各样品中乙醇含量，各做3个平行。同时用生物传感器测定各样品中乙醇含量，作为参照。

2 结果与分析

2.1 标准曲线（图2）

图2 重铬酸钾标准曲线

从图2可看出，乙醇浓度在0.2～1.4 g/L的范围内与吸光度线性关系良好，线性回归方程为y=6.8141x+0.0365（R2=0.9993），其中x是吸光度值，y是乙醇浓度。则乙醇浓度计算公式为：乙醇浓度（g/L）=[（吸光度Ⅰ-吸光度Ⅱ）×6.8141+0.0365]×稀释倍数。

2.2 煮沸方式及时长的探索结果

煮沸方式和时长对残留乙醇浓度的影响见表1。由表1可知，两种煮沸方式均可。煮沸时长2 min及以上时，发酵液中的乙醇基本完全挥发，故选定煮沸时长为2 min。

表1 煮沸方式和时长对残留乙醇浓度的影响

2.3 煮沸对YPD的影响（表2）

表2 煮沸对YPD溶液的影响

由表2可知，煮沸前的YPD待测液与重铬酸钾反应所得的吸光度，和煮沸、补水后的YPD待测液与重铬酸钾反应所得的吸光度几乎没有差别。说明煮沸不会使YPD溶液中的还原性物质与重铬酸钾反应的能力发生变化。

2.4 回收率及精密度实验结果（表3）

由表3可知，在YPD溶液中添加20 g/L的乙醇，本法回收率为98.58%～102.14%，相对标准偏差（RSD）为1.52%（n=6），说明本法精密度良好。

2.5 发酵液、葡萄酒、啤酒中乙醇浓度的测定结果（表4）

如表4所示，用本法测定了5个样品的乙醇含量。经t检验，本方法所得结果与生物传感器所测得的结果均没有显著差异，p＞0.05。本方法与生物传感器法的差异为0.36%～1.74%,说明本方法准确度良好。

表3 回收率及精密度试验结果

表4 发酵液、葡萄酒、啤酒中乙醇浓度测定的结果

3 讨论

本方法能准确地测定发酵液中的乙醇含量。检测的精密度、准确度、回收率等各项指标均达到分析要求。本法还能测定葡萄酒、啤酒等有色酒中的乙醇含量。

笔者在进行酿酒微生物相互作用的研究中，涉及发酵液中乙醇含量的测定，结合实验室条件和有大量样品需要测定的实际需求，建立了本测定方法。本方法可以同时处理多个样品，不需要像气相色谱法和液相色谱法那样依次进样，也不需要像密度瓶法、酒精计法那样依次蒸馏，当样品量多时，本方法能节省大量检测时间。

限于本方法的原理，目前不能排除甲醇、丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇等挥发性醇类对实验结果的干扰，不过酿酒相关实验和生产中所涉及的发酵液的乙醇含量远远高于其他挥发性醇，所以本方法适用于酿酒相关实验和生产。本方法不需要昂贵的仪器设备，成本低廉，可以得到广泛的应用。

参考文献：

[1]冯东,王丙莲,梁晓辉,等.生物传感器法快速测定酒中的乙醇含量[J].酿酒科技,2012(2)：83-86.

[2]赵洪庆,高红波,钟其顶,等.乙醇传感器法测定葡萄酒和黄酒中乙醇的含量[J].食品工业科技,2014,35(19)：293-296.

[3]牟建楼,王颉,张伟,等.乙醇的测定方法综述[J].酿酒,2006(2)：46-48.

[4]范继青,陈念祖,黄滔敏.柱前衍生化-HPLC法测定乙醇消毒液中乙醇的含量[J].中国临床药学杂志,2016,25(2)：89-92.

[5]邓少东,肖凤霞.一种小鼠血清中乙醇含量测定的简易方法[J].广东医科大学学报,2017,35(1)：33-35.

[6]葛奉娟,王欲晓,周俊,等.重铬酸钾氧化比色法和气相色谱法定量分析发酵液中乙醇的比较研究[J].徐州工程学院学报(自然科学版),2011,26(2)：64-68.

[7]何川,章登政,张俊,等.重铬酸钾-DNS比色法测定发酵液中乙醇含量[J].生命科学研究,2013,17(1)：1-4.