下肢静脉性溃疡大鼠模型建立与评价

王 茜，赵 钢

下肢静脉性溃疡是外科常见病、多发病，是下肢慢性静脉功能不全后期的主要临床表现之一[1]，中医称“臁疮”、“老烂腿”。该病可导致慢性疼痛、残疾、生活质量下降，常见发病部位为小腿中下段前内侧面,即足靴区，其次是内踝、外踝和足背区[2]，深静脉瓣膜功能不全引起的静脉高压是其主要原因。其特点为病程长,反复发作,愈后有复发性,少数有癌变，对患者的生活质量和身心健康造成严重的不良后果，是外科创面修复的一大难题。因此，建立可行的下肢静脉性溃疡模型，为治疗提供基础研究非常必要的。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性SD大鼠20只，SPF级，体质量(250±20) g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供,许可证号SCXK鲁20140001。在安静环境下适应性饲养1周，室温(22±2)℃，相对湿度55%～60%。给予充足清洁饮水，自由摄食。

1.2 主要试剂与仪器 血浆D-二聚体测定试剂盒购自南京建成生物有限公司。日本OLYMPUS显微镜；HD-850型桌上式洁净工作台（苏州净化）；美国Moticam3000显微摄影成像系统；电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；切片机，包埋机，脱水机(德国 Leica公司)。水合氯醛天津市光复精细化工研究所生产。大鼠IL-6、IL-8、TNF-α ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 分组及模型建立 适应性饲养1周，筛选皮肤无损伤的合格动物。采用下肢深静脉血栓模型与局部皮肤缺损模型相结合方法制备模型。将模型制备成功的大鼠随机分为模型组、对照组，每组10只。分别在第7、14 d取创面组织进行相关检测。对照组只造成局部皮肤缺损。

模型建立：(1)大鼠下肢深静脉血栓形成模型制备[3]。大鼠置于无菌操作台，腹腔注射10%水合氯醛麻醉。剪去左侧大腿根部毛发,仰卧位固定。常规无菌消毒,铺无菌孔巾。在左侧腹股沟内侧做长约2 cm切口,分离皮下组织和浅筋膜等,分离并暴露髂-股静脉约1.0 cm。见图1。在其近、远心端用动脉夹夹闭此静脉,用自制的同一把无齿的12号蚊式钳夹闭血管，压力为血管钳紧一扣,时间持续3 s，于动脉夹位置相邻。松开蚊式钳并进行缝合,局部皮肤常规消毒。手术后24 h将放置血管夹取出。(2)局部皮肤缺损模型。下肢深静脉血栓模型制备成功3 d,大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，剪去左侧大腿外侧毛发，保证皮肤完整无破损。取适量脱毛膏脱毛, 直径约为3 cm。俯卧位固定，局部皮肤常规无菌消毒,铺无菌孔巾,直径1.5 cm打孔器标记造模位置。剪取标记位置全层皮肤,造成直径1.5 cm圆形皮肤缺损，深度达皮下深筋膜。见图2、3。分笼单个饲养，笼具内铺垫无菌纱布，同时注意保暖，观察大鼠皮损变化和一般行为状态。

1.4 一般行为、体征观察 造模期间, 每日观察并记录各组大鼠的生理、行为特征,疮面形态,疮面分泌物及体质量变化。溃疡面积计算方法：于造模后药物治疗的7 d、14 d，用数码相机照相经Photoshop软件分析及透明生物膜覆盖创面并沿创缘描膜以记录创面面积,计算创面愈合率。创面愈合率=1-创面面积/创面原始面积×100%。计算皮肤溃疡剩余面积[4]。

1.5 组织病理学检查 切取0.5 cm大小的溃疡创面皮肤组织，经4%多聚甲醛固定24 h，常规脱水、透明、浸蜡和包埋，制备6 μ m组织切片进行病理染色。显微镜下观察皮肤组织病理变化。

1.6 血液指标测定 (1)血液流变测定。空腹静脉血经肝素抗凝，血液流变仪测定切变率为10 s、200 s时的全血粘度。余下全血经3500 r/min 离心10 min，取血浆进行测定血浆粘度(CP)和纤维蛋白原(FIB) 以及红细胞聚集指数(RCAI)。（2）血浆D-二聚体测定（D-D）。空腹状态下取大鼠静脉血，用柠檬酸钠抗凝处理，3500 r/min 离心15 min，取上层乏血小板血浆进行测定。采用胶乳增强免疫比浊法检测血浆D-D浓度。

1.7 检测血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平 按照ELISA试剂盒说明，使用酶标仪检测各样本的吸光度A，计算血清IL-1β、IL-6 和TNF-α的各组小鼠血清中的浓度。

2 结果

2.1 行为学变化及成模率 大鼠在成模后，大鼠一般状态良好，活动自如，体质量减轻，随着时间推移，创面溃疡部分有愈合，面积较之前缩小。模型组造模成功后，于造模第2 d死亡俩只，剩下8只均已成活，合计成模率80%。对照组10只大鼠均成活，成模率为100%。

2.2 组织病理学改变 模型组与对照组观察14 d，模型组可见正常细胞组织破坏明显，大量炎细胞增生，纤维结缔组织增生。对照组可见少量炎性细胞浸润及坏死中性粒细胞。见图4。

图4 模型组与对照组第14 d病理改变（HE×400）

2.3 溃疡面积变化 模型组与对照组7 d、14 d观察发现，溃疡面积明显大于对照组。在7 d、14 d创面愈合率则明显低于对照组。见表1。

表1 大鼠造模后第7、14天溃疡面积变化（±s）

表1 大鼠造模后第7、14天溃疡面积变化（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05

创面愈合率（%）模型组 7 8 1.48±0.09a 16.0±5.5a 14 8 1.23±0.07a 30.4±4.0a对照组 7 10 0.83±0.04 13.1±1.8 14 10 0.49±0.03 47.7±5.5时间（d）N（只）溃疡面积（cm2）

2.4 血流变与血浆D-D变化 模型组与对照组比较，在7 d、14 d DD值明显高于对照组。与对照组相比，模型组 7 d、14 d FIB、全血粘度10 s、全血粘度200 s、RCAI以及血浆粘度值均高于相对应的对照组。见表2。

表2 大鼠模型血流变与血浆D-D在造模前后的变化（±s）

表2 大鼠模型血流变与血浆D-D在造模前后的变化（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05

n 时间（d） D-D（mg/l） FIB(g/l) 全血粘度10s(mPa/s)全血粘度200s(mPa/s) RCAI 血浆粘度(mPa/s)模型组 8 7 0.60±0.07a 6.21±0.58a 17.54±1.42a 6.21±0.54a 2.78±0.17a 1.80±0.12a 14 0.66±0.07a 7.44±0.74a 18.93±1.70a 6.55±0.38a 2.88±0.20a 1.94±0.16a对照组 10 7 0.30±0.02 3.08±0.19 12.44±1.49 5.15±0.55 2.42±0.31 1.40±0.08 14 0.29±0.01 2.92±0.27 12.81±0.99 5.45±0.49 2.35±0.21 1.35±0.07

2.5 血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平 模型组血清IL-1β、IL-6、TNF-α在7 d与14 d的水平变化均高于对应的对照组（P＜0.05）。见表3。

表3 大鼠模型血清IL-1β、IL-6和TNF-α浓度变化（±s）

表3 大鼠模型血清IL-1β、IL-6和TNF-α浓度变化（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05

时间（d） IL-1β（pg/mL） IL-6（pg/mL） TNF-α（pg/mL）模型组 8 7 141.91±10.76a 183.30±17.43a 108.35±8.05a 14 151.88±10.39a 180.40±20.28a 130.49±16.37a对照组 10 7 110.01±12.59 150.34±22.36 78.83±9.23 14 107.40±9.21 130.82±11.44 74.73±7.11 n

图1 大鼠血栓模型建立中，分离髂-股静脉

图2 大鼠血栓模型建立后，在大鼠左下肢取直径1.5cm的圆形切口

图3 大鼠溃疡模型成立

3 讨论

下肢静脉性溃疡是由于各种原因引起的下肢静脉瓣膜功能不全，静脉血流动力学发生改变，产生浅静脉、深静脉或交通支静脉血液异常反流，引起静脉压力升高，而形成的难治性溃疡[5]。

血浆D-二聚体是血浆中的纤维蛋白原在凝血酶作用下形成纤维蛋白单体，是纤溶酶作用于交联蛋白的特异性分子标志物[6]。作为血液凝结状态和纤溶亢进指标的特点是具有非常强的特异性，血浆中其含量增高反映纤溶酶活性增强和凝血酶生成增多[7-8]，用其结果来证明血栓模型的成立是可行的。血流变是研究血液有形成分的流动性及其变化规律的科学，反映血液粘滞度的重要指标，这些指标的测定对于预防和监测血栓性疾病的发生发展都有重要意义[9]。从本实验结果可见，模型组指标明显高于对照组，从而证明了血栓模型的成功建立。对于大鼠溃疡模型的成立，主要是通过大鼠的后期体征及创面面积观察，后期模型的溃疡面积变大，愈合率降低，都可以证明溃疡模型建立良好。病理方面提示，相比于对照组，细胞被破坏更严重，细胞结构疏松，炎细胞增生明显多于对照组，有纤维结缔组织增生均可验证，本实验模型的建立成功。

TNF-α 能刺激 IL-1、IL-6、IL-8 的产生 ，并激活地诺前列酮和胶原酶，引起血管生成；TNF-α与转化生长因子可产生协同效应，诱导血管生成[10]，通过产生 IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等因子引起炎症[11]。IL-1β是白细胞介素1 拥有众种生物学效应，特别在炎症反应、免疫调节，调整创伤组织的修复过程中作用明显，也是体内作用较强的炎症细胞因子[12]。IL-6是敏感反映机体炎症与组织损伤严重程度的重要指标[13]，在机体创伤和修复过程中的急性期反应期起着重要的作用[10]。这三种炎症因子贯穿的整个溃疡模型的整个过程，溃疡越严重则炎症反应越重，实验结果中，模型组的指标要比对照组明显增高，这就证明了下肢静脉性溃疡的成功建立。目前，有溃疡模型主要是大鼠胃溃疡以及糖尿病足的溃疡模型[14]，尚未有大鼠下肢溃疡模型的建立的报道，没有成熟的下肢溃疡模型，故本模型的建立是一次创新，在成模率来看，可行性较高。

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