几种饮品中水溶性糖的HPLC-ELSD 法检测

芦广银 ，吴福芳 ，朱 静 ，马扩彦 ，戴 亚 ，盛良全 *

（1.阜阳师范学院 化学与材料工程学院，安徽 阜阳 2360370；2.重庆中烟工业有限责任公司 技术研发中心,重庆 400060）

市场上饮品种类繁多,有茶饮品、碳酸饮品、果汁饮品、乳酸菌饮品和饮品酒等，大部分饮品只标注了碳水化合物的总含量，未具体标注碳水化合物的种类和含量。饮品中的水溶性糖主要包括果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖[1-3]，其中蔗糖含量比较高，蔗糖摄入过量会导致龋齿、肥胖等疾病[4-6]，对人类生活造成一定的威胁，尤其是老年人和特殊人群[7]。因此，找到快捷、简单并能广泛应用的饮品中水溶性糖的测定方法十分必要。

水溶性糖的测定方法有化学法、酶比色法、酶电极法、毛细管电泳法[8]和高效液相色谱法等[9-12]。化学法[13]一般用于还原糖和总糖的测定[14-15]，操作复杂，无针对性，通常采用碱性酒石酸铜直接滴定法和高锰酸钾滴定法，均利用糖的还原性，笼统地以还原糖或总糖表示结果，无法测定各种糖的具体含量[16]；酶比色法、酶电极法[17-18]是一种只针对葡萄糖分析方法，测定蔗糖要用β-果糖苷酶转化为葡萄糖后测定，检测结果受酶纯度及酶活性的影响[19]；HPLC-ELSD法可同时测定多种糖，方法简单可靠、灵敏度高、重现性好、应用范围广[20-22]，其优点源于采用了ELSD；ELSD是一种通用型质量检测器，基于不挥发的样品颗粒对光的散射程度与其质量成正比进行测定，对没有紫外吸收、荧光或电活性的物质均能产生响应[23]；稳定性好，灵敏度高，无溶剂峰干扰，弥补了HPLC传统检测器的不足[24]；与荧光检测器相比，应用范围更广；与示差检测器相比，避免了对工作环境、流速、温度的苛刻要求和无法进行梯度洗脱的局限性[25]。本实验研究采用HPLC-ELSD法测定饮品中果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖等水溶性糖含量。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

材料：冰红茶、可乐、鲜果橙、小洋人乳酸菌饮料和干红葡萄酒（法国卡斯特兄弟股份有限公司）。

试剂：L-（+）-鼠李糖（BR，上海展云化工有限公司）；D（+）-木糖（BR，上海展云化工有限公司）；D-果糖（GR，上海试剂二厂）；D-甘露糖（AR，公私合营恒信化工厂）；D-葡萄糖（AR，北京化工厂）；蔗糖（GR，国营上海试剂厂）；乳糖(AR，广州仁人制药厂；乙酸锌（CP，洛阳化学试剂厂）；冰醋酸（AR，上海强顺化学试剂厂）；亚铁氰化钾（CP，北京红星化工厂）；乙腈(色谱纯，上海星可高纯溶剂有限公司）；甲醇（色谱纯，北京迈瑞达科技有限公司）；高纯氮（99.99%，纯N2）（合肥众益化工产品有限责任公司）。

仪器：YL9100高效液相色谱（HPLC），YL9180蒸发光检测器（ELSD）（南昌捷岛科学仪器有限公司）；J-K100DB型数控超声波清洗器（合肥金尼克机械制造有限公司）；0.45 μm水系微孔滤膜。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

碳酸饮品处理方法：冰红茶、可乐、鲜果橙分别取2.00 mL至100.00 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，混匀。用0.45 μm滤膜将样液过滤后，取样20 μL进行色谱分析，（其中可乐要经过超声振荡半小时）；红酒取10.00 mL至100.00 mL容量瓶中，方法同上。

乳酸菌饮品处理方法：准确吸取某品牌小洋人乳酸菌饮品2.00 mL至100.00 mL容量瓶中，加20 mL水并缓慢加入乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液各2.00 mL，加水定容至刻度，混匀，静置30 min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，取续滤液过0.45 μm 滤膜，取样 20 μL进行色谱分析。

1.2.2 标准溶液配制

分别准确称量0.200 0 g(精确至0.000 1 g)经干燥至恒重的鼠李糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖标准品，再分别准确称量0.040 0 g、0.080 0 g、0.120 0 g经干燥至恒重的木糖、果糖、甘露糖标准品，分别溶解于50 mL烧杯中，后转移至100.00 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀即得糖标准储备液，置于4℃冰箱中保存。分别吸取不同体积的上述标准储备溶液于不同规格的容量瓶中，配置成不同浓度的溶液，摇匀即得一系列糖标准工作液。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：糖分析柱Zorbax Carbohydrate（4.6 mm × 250 mm，5 μm），（南昌捷岛科学仪器有限公司）；流动相∶乙腈/水（77/23，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温为：25℃；漂移管温度60℃；ELSD Spray Chamber温度为30℃；氮气压力为0.5 Mpa;进样20 μL。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件

2.1.1 流动相的选择

同1.2.3方法，改变流动相，其它条件不变，分别在乙腈-水溶液体积比为 75∶25、77∶23、80∶20进样20 μL检测分析各组分糖的分离情况，见表1。结果表明，水在流动相中的比例减小，被测物质的保留时间延长，分离度有一定提高，分离时间过长，导致峰形展宽；当乙腈和水的比例为75∶25时，木糖和果糖的峰部分重叠，葡萄糖和甘露糖的峰部分重叠，分离效果不佳，当比例为77∶23时，所有的糖基本都已分开，且峰形比较好，继续降低水的比例分离度增大，分离时间延长，峰形展宽严重。因此，选择乙腈和水的比例为77∶23(V/V)进行分析。

2.1.2 流速的选择

同1.2.3方法，改变流速，其它条件不变，见表2。结果表明，提高流速，被测物质的保留时间缩短，分离度下降，当流速为1.2 mL/min时，木糖和果糖的峰部分重叠，分离效果不佳，继续降低流速，分离度有一定提高，分离时间过长，峰形展宽严重。因此，选择流速为1.0 mL/min进行分析。

2.1.3 柱温的选择

同1.2.3方法，改变柱温，其它条件不变，见表3。结果表明，分离时间和分离度受柱温影响不大。因此，选择室温即25oC条件进行分析。

2.1.4 ELSD参数的选择

根据吴福芳等的《HPLC-ELSD法检测烟草秸秆中水溶性糖》文章[26]设置ELSD参数，以推荐值为起点，逐渐改变漂移管温度或载气流速，观察基线噪音和响应信号的大小。结果表明，当漂移管温度为60℃，ELSD Spray Chamber温度为30℃，氮气压力为0.5 Mpa，分流阀开时，噪音最小，响应信号最强，故确定此条件为最佳条件。

表1 不同流动相下各组分糖的分离度

表2 不同流速下各组分糖的分离度

表3 不同柱温下各组分糖的分离度

2.2 样品测定

2.2.1 7种水溶性糖的HPLC分析

同1.2.3方法，取混有7种水溶性糖的样液20 μL进样分析，见图1。结果表明7种水溶性糖在此色谱条件下，基本分离，分离时间不超过20 min，峰形窄且对称，分离效果好。

2.2.2 线性范围和检出限

同1.2.3方法，取系列标准工作液20 μL进样分析，以标准工作液峰面积对浓度进行线性回归，即可得到7种水溶性糖的回归方程；根据公式检出限=3倍仪器噪声信号÷标准曲线回归方程斜率，测定7种水溶性糖检出限，见表4。结果表明果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖在10.00～2 100.00 mg/L范围内呈良好线性关系，检出限在3.00～9.00 mg/L范围内。

图1 7种水溶性糖混合标准液的HPLC-ELSD色谱图

表4 7种水溶性糖类化合物的回归方程

表5 样品7种水溶性糖的含量/mg/mL

2.2.3 样品水溶性糖含量

同1.2.3方法，分别取5种处理好的饮品样液20 μL进样分析，并根据线性回归方程求得样品中水溶性糖含量，见表5。

结果表明，在所测得5种饮品中都不含有鼠李糖和木糖，但都含有果糖和葡萄糖；采用HPLCELSD法检测饮品中各水溶性糖总含量和饮品商标提供的碳水化合物含量一致，如某品牌冰红茶中总糖浓度约为93.75 mg/mL，红酒的含糖量小于4 mg/mL等；鲜果橙和冰红茶中蔗糖含量较高，干红葡萄酒中总糖含量很少，为人们对饮品中糖摄取量的关注提供了一定的参考。

2.2.4 精密度和方法稳定性

同1.2.3方法，取处理好的鲜果橙样液20 μL进样分析，平行测定6次。根据果糖、葡萄糖、蔗糖的峰面积计算其含量，求得相对标准偏差(RSD)分别为0.621%、0.239%和0.641%，RSD均小于1%。结果表明该方法精密度良好；取同一鲜果橙样品溶液，每隔2 h进样分析1次，分别测得一天内果糖、葡萄糖、蔗糖的含量变化，得到果糖、葡萄糖、蔗糖含量变化的RSD分别为3.251%、6.254%、0.789%。结果表明饮品中葡萄糖和果糖浓度随时间变化比较大，为了不影响样品中水溶性糖含量的测定，处理好的样品最好在2 h内进样检测分析。

2.2.5 回收率

在已知糖含量的鲜果橙样品中分别加入一定量的鼠李糖、木糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖，按1.2.1方法处理成待测溶液，取样液20 μL进样分析，平行测定3次，按照外标法定量并根据公式回收率＝（加标试样测定值―试样测定值）÷加标量×100%计算其回收率，见表6。结果表明7种糖的回收率均在73.1%～114.8%范围内。

表6 样品加标回收率

3 小结

本实验研究采用HPLC-ELSD法检测几种常见饮品中水溶性糖含量，测得饮品总糖含量和饮品商标提供的碳水化合物含量一致，几种水溶性糖的回收率均在73.1%～114.8%范围之内，精密度小于1%，检出限在3.00～9.00 mg/L范围，与传统检测水溶性糖的方法相比，该法具有灵敏度高、线性范围宽、重现性和稳定性好以及无其它杂质干扰、简便、快速等优点，从而建立了一种简便、准确、灵敏测定饮品中果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖等水溶性糖含量的HPLC-ELSD检测方法，为人们对饮品中各种糖的摄取量提供一定的参考。

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