白藜芦醇缓解高脂饲喂小鼠的胰岛素抵抗与调控肝脏线粒体功能作用研究

王翠雪，王 丽，钱伟伦，于志文，王英豪

（福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

胰岛素抵抗是肥胖、代谢综合征和2型糖尿病等疾病的基础机理，又与线粒体功能的损害密不可分［1］。而线粒体功能与线粒体分裂和融合的形态和功能改变密切关联，当线粒体功能损害时，一方面造成能量代谢紊乱，另一方面通过产生过氧化物并激活炎症等信号途径产生对胰岛素信号的负反馈调节等，从而进一步诱发或加重胰岛素抵抗和糖尿病等疾病的发生发展。

白藜芦醇是一种存在于虎杖、藜芦、花生、葡萄等天然植物的多酚化合物。十年多来的大量研究证实：白藜芦醇具有明确的改善胰岛素抵抗作用［2］。然而，白藜芦醇的药效机理尚未完全阐明，尤其是其对线粒体功能的调节作用与胰岛素抵抗的相关研究尚很不足。本研究通过高脂诱导小鼠胰岛素抵抗模型，用白藜芦醇药物灌胃进行短期干预后，检查与肝脏线粒体调控相关的信号蛋白表达和线粒体功能等生化指标，以及肝脏炎症信号关键蛋白的表达，探讨白藜芦醇是否可能通过调节线粒体功能和炎症，起到改善胰岛素抵抗的药效作用。

1 实验材料

1.1 实验动物与试剂 8周龄SPF级雄性C57BL／6J小鼠（许可证号：SCXK沪2013-0018）；低脂饲料（4.5%脂肪）、高脂饲料（45%脂肪）均购自广州省医学实验动物中心；白藜芦醇（成都曼斯特生物科技有限公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；Na＋K＋、Ca＋＋Mg＋＋-ATP 酶测定试剂盒（南京建成生物科技有限公司）；ECL显影液（北京康为世纪生物科技公司）；IKBα、TNF-α、Mfn2、OPA1、Drp1 抗体（美国 Cell Signaling公司）；GAPDH抗体（美国Santa Crue公司）。

1.2 实验仪器和材料Trans-Blot小型电泳及转印槽、转模仪（美国Bio-Rad公司）；血糖仪和血糖试纸（上海鱼跃医疗设备有限公司）；ChemiDocXRS化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司）。

2 实验方法

2.1 胰岛素抵抗模型的建立及药物干预 8周龄SPF级雄性C57BL／6J小鼠30只，随机分为低脂对照组（n＝10）、高脂模型组（n＝20），分别用低脂饲料（4.5%脂肪）和高脂饲料（45%脂肪）喂养。饲喂12周后，通过葡萄糖耐量实验（IPGTT）检测胰岛素抵抗模型是否成功建立。再将成功的胰岛素抵抗模型小鼠随机分为模型组（n＝10）、药物组（n＝10）。 药物组给予白藜芦醇50 mg／kg剂量每天灌胃1次，而对照组和模型组按体重给予等量生理盐水每天灌胃1次，连续干预10 d。

2.2 血糖测定 3组小鼠连续干预10 d后，禁食12 h，取小鼠尾椎静脉血检测空腹血糖。然后每只小鼠腹腔注射 1.5 g／kg葡萄糖，分别于 15、30、60 min和120 min尾椎静脉取血测定血糖。

2.3 组织蛋白样品制备 3组小鼠禁食12 h后，脊椎脱臼处死，迅速取出小鼠肝脏，放入液氮速冻5 min，置于-80℃冰箱储存。取50 mg肝脏组织，加入预冷的细胞蛋白裂解液，在冰上用组织研磨器匀浆，放入离心机内14 000 rpm，4℃离心10 min，取上清。BCA试剂盒检测蛋白浓度，制备蛋白样品。

2.4 免疫蛋白印迹（Western Blot） 蛋白样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳后转于硝酸纤维素膜上，用5%脱脂牛奶 TBST 室温封闭 2 h，一抗（1∶1000） 4℃孵育过夜，二抗（1∶2000）稀释室温反应 2 h，洗脱剂TBST洗涤4次，用ECL显影曝光并记录。

2.5 Na＋K＋、Ca＋＋Mg＋＋-ATP-pase 含量测定 称取小鼠肝脏组织 30 mg，按重量 ／g∶体积 ／mL＝1∶9 的比例，加入生理盐水，冰上组织研磨器匀浆，3 000转／min，离心10 min，取上清，BCA试剂盒检测蛋白浓度。 根据 Na＋K＋、Ca＋＋Mg＋＋-ATP 酶测试盒说明书操作。

2.6 统计学方法 数据使用软件SPSS20.0统计分析。计量资料属正态分布以（x±s）表示，采用单因素方差分析检验。

3 实验结果与分析

3.1 白藜芦醇缓解高脂诱导胰岛素抵抗的糖耐量异常 高脂饲料喂养12周后，模型组小鼠糖耐量明显损害，见图1；白藜芦醇药物干预10 d后，药物组小鼠血糖明显低于模型组，见图2。白藜芦醇明显改善高脂诱导的胰岛素抵抗。

图1 高脂饲料造模12周后糖耐量实验结果图

图2 白藜芦醇缓解胰岛素抵抗小鼠糖耐量异常

3.2 白藜芦醇抑制高脂造成的肝脏线粒体形态调控蛋白和功能异常 在小鼠肝脏组织中，白藜芦醇促进线粒体融合蛋白 Mitof Usin2（Mfn2）、Optic Atroploy1（OPA1）表达，抑制线粒体促分裂蛋白Dyaminrelated Protein1（Drp1）的表达，见图3。模型组与对照组比较，模型组小鼠肝脏中 Ca＋＋Mg＋＋、Na＋K＋ATP-pase含量明显降低，而药物组可以明显逆转这一现象，增加 Ca＋＋Mg＋＋、Na＋K＋ATP-pase含量。见图4～5。

图3 3组小鼠肝脏线粒体形态调控蛋白信号变化图

图4 3组小鼠肝脏线粒体调控蛋白密度统计图

图5 3组小鼠肝脏ATP酶活性含量图

3.3 白藜芦醇明显抑制肝脏的炎症信号及相关因子 白藜芦醇可以明显增加小鼠肝脏组织中NF-kB的抑制性蛋白IκBα的表达，相应地减少肿瘤坏死因子（TNF-α）蛋白的表达。见图6～7。

图6 3组小鼠肝脏炎症信号蛋白变化图

4 讨 论

图7 3组小鼠肝脏炎症信号蛋白密度统计图

线粒体作为能量代谢的最重要细胞器，近年相关研究的重要进展之一是线粒体分裂和融合的线粒体形态变化与线粒体功能密切相关。前期研究证实线粒体调控的几种关键蛋白，即Mitofusin 1（Mfn1）、Mfn2和OPA1在高脂模型小鼠肝脏均受到抑制［3］，相反，线粒体促分裂蛋白 Drp1明显升高，这一结果与已有的报告结果一致［4］，并提示在高脂胰岛素抵抗情况下，抑制了线粒体融合。本研究进一步表明：白藜芦醇短期干预则可明显缓解和逆转高脂造成的这些线粒体调控蛋白的异常，线粒体ATP-pase的检测结果也支持白藜芦醇干预可以缓解高脂饲喂造成的小鼠肝脏线粒体功能障碍。

在线粒体功能障碍时，一方面其正常产能作用损害，另一方面线粒体产生的过氧化物增加［5］，线粒体可以改变氧化还原平衡状态，激活炎性信号蛋白［6］。另外，线粒体与NF-κB炎性信号通路之间也有密切的对话，通过激活炎症起到抑制胰岛素信号传导和功能作用［7］。本研究证实，白藜芦醇可以抑制高脂造成的 IκBα降低并抑制肿瘤坏死因子（TNF-α）炎性因子的表达。

参考文献：

［1］ 时丽丽，张莉，谭初兵，等.线粒体功能损伤与胰岛素抵抗［J］.中国药理学通报，2012，28（11）：1481-1486.

［2］ 陈莉，陈冠军，陈兵，等.白藜芦醇改善高脂血症小鼠脂肪组织胰岛素抵抗的机制探讨［J］.安徽医科大学学报，2014，49（8）：1104-1109.

［3］ LIU K，ZHOU R，WANG B，et al.Effect of resveratrol on glucose control and insulin sensitivity：a meta-analysis of 11 randomized controlled trials ［J］.American Journal of Clinical Nutrition，2014，99（6）：1510-1519.

［4］ KRUSE M，SEKI Y，VUGUIN P M，et al.High-fat intake during pregnancy and lactation exacerbates high-fat diet-indulced complications in male offspring in mice ［J］.Endocrinology，2013，54（10）：3565-3576.

［5］ LANG A，ANAND R，ALTINOLUKHAMBUCHEN S，et al.SIRT4 interacts with OPA1 and regulates mitochondrial quality control and mitophagy ［J］.Aging，2017，9（10）：2163.

［6］ ASADI S，MORADI M N，KHYRIPOUR N，et al.Resveratrol Attenuates Copper and Zinc Homeostasis and Ameliorates Oxidative Stress in Type 2 Diabetic Rats ［J］.Biological Trace Element Research，2017，177（1）：132-138.

［7］ FENG J，LIU S，MA S，et al.Protective effects of resveratrol on postmenopausal osteoporosis：regulation of SIRT1-NF-κB signaling pathway ［J］.生物化学与生物物理学报（英文），2014，46（12）：1024-1033.