气相色谱串联质谱法检测食用植物油中的4种欧盟限量多环芳烃

王国庆，王宗义，马子夏，马蒙蒙，翟孟婷，郑宇

（北京农学院食品科学与工程学院，食品质量安全北京实验室，农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室，北京 102206）

多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAH)是由有机物不完全燃烧或高温分解产生的一类食品污染物[1]。由于亲脂性强，食用油较易受到PAH的污染，研究显示，污染最严重的是屈(CHR)，其次是苯并[a]芘(BAP)、苯并[b]荧蒽(BBF)和苯并[a]蒽(BAA)[2]，其中BAP为一级致癌物，BAA、CHR和BBF为二级致癌物[3]。目前，我国规定食用油中BAP的安全限量为10 µg/kg[4]，对其他PAH未做限定；而欧盟则相对更为严格，除规定BAP的限量为2 µg/kg，还规定BAP与 BAA、CHR和 BBF四种 PAH的总限量为 10µg/kg[5]。因此，建立简便、实用和相对快速的食用油中这4种PAH(PAH4)检测方法，对监测和评价食用油的安全质量具有重要意义。

关于 PAH检测方法，主要有高效液相色谱法(HPLC)[6~8]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[9,10]、气相色谱串联质谱法(GC-MS/MS)[11,12]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[13,14]，也有毛细管电泳法(CE)[15]和同步荧光光谱法(SFS)[16]的报道。其中，GC-MS/MS和LC-MS/MS由于具有更为突出的选择性和检出能力，在一定程度上降低了样品前处理方法的难度，成为近年来检测 PAH更为有效的技术手段。但就植物油而言，由于目标物含量低、以甘油酯为主体的样品基质容易饱和色谱柱、迅速降低柱效和污染离子源，因此，样品除脂技术仍然是制约 PHA检测的关键，通常需要使用凝胶渗透色谱法[17~19]、固相萃取[20~22]、固相微萃取[23]以及在线净化技术[24]等完成。

本研究根据分子印迹(MIP)材料对重质PAH选择性保留较好的特点，结合GC-MS/MS的高灵敏、高选择性，以CHR-d12、BAP-d12为内标，建立了正己烷溶样，MIP固相萃取除脂，GC-MS/MS检测，相对简便、快速，用于检测食用植物油中4种欧盟限量PAH的新方法，并对市场食用油样品进行抽样检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

26个食用油，购自北京地区超市，包括6个大豆油、4个花生油、3个调和油、5个玉米油、2个葵花油和6个芝麻油。苯并[a]蒽(BAA)二氯甲烷标准溶液(200 mg/L，1 mL)，屈(CHR)二氯甲烷标准溶液(200 mg/L，1 mL)，苯并[b]荧蒽(BBF)二氯甲烷标准溶液(200 mg/L，1 mL)，苯并[a]芘(BAP)二氯甲烷标准溶液(200 mg/L，1 mL)，CHR-d12二氯甲烷标准溶液(2000 mg/L，1 mL)，BAP-d12甲醇标准溶液(1000 mg/L，1 mL)美国o2si公司；甲醇、正己烷和二氯甲烷(色谱纯)美国J. T. Baker公司。

分子印迹固相萃取柱 Cleanert Bap-3-SPE：500 mg/6 mL、硅胶固相萃取柱Cleanert Silica-SPE：500 mg/6 mL，天津博纳艾杰尔公司。

1.2 仪器与设备

GC7890B-7000C气相色谱串联质谱仪，美国Agilent公司；BF-2000氮气吹干仪、CNW12位固相萃取装置，北京八方世纪科技有限公司；IKA MS 3 basic涡旋混匀器，德国IKA公司。

1.3 标准溶液配制

分别将4种定值标准溶液和CHR-d12定值内标溶液，用二氯甲烷稀释至10 mL容量瓶中，得到浓度为20 µg/mL的4种混合标准储备液和浓度为200 µg/mL的CHR-d12标准储备液，于棕色贮液瓶中-20 ℃储存；将BAP-d12定值标准溶液，用甲醇稀释至10 mL容量瓶中，得到浓度为100 µg/mL的BAP-d12标准储备液，于棕色贮液瓶中-20 ℃储存。用二氯甲烷稀释所有标准储备液，得到4种混标浓度分别为1 µg/L、5 µg/L、10 µg/L、25 µg/L和50 µg/L，2种内标浓度为10 µg/L的标准工作液。

1.4 样品前处理

1.4.1 样品制备

称取0.5 g食用油样品于10 mL离心管中，加入40 µL 0.25 µg/mL BAP- d12 和 40 µL 0.25 µg/mL CHR-d12，加入3 mL正己烷涡旋震荡溶解，作为待净化液。

1.4.2 样品净化

在 Cleanert Bap-3固相萃取柱上端串联一支Cleanert Silica固相萃取柱，依次用5 mL二氯甲烷、5 mL正己烷活化小柱，将上述待净化液上样到小柱上，用2 mL正己烷润洗试管，将润洗液一同上样到小柱上；先用5 mL正己烷淋洗串联柱，待溶液完全滴至Cleanert Bap-3固相萃取柱上，将Cleanert Silica固相萃取柱弃去，再用5 mL正己烷淋洗Cleanert Bap-3固相萃取柱，弃去淋洗液；最后用5 mL二氯甲烷洗脱，收集洗脱液。将收集的洗脱液置于 40 ℃下氮吹至 1 mL，转移到进样瓶中，待上机检测。

1.5 气相色谱-质谱条件

1.5.1 气相色谱条件

色谱柱：DB-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 µm)；程序升温：初始温度为50 ℃，保持1 min，以15 ℃/min升至250 ℃，保持1 min，再以8 ℃/min升至280 ℃，保持 6 min；载气(He，纯度>99.999%)流速为 1.0 mL/min，进样口温度为250 ℃，不分流进样，进样体积为 1 µL。

1.5.2 质谱条件

离子源温度为230 ℃，电离模式为电子轰击离子源(EI)，溶剂延迟时间为6 min，MSD传输线温度为280 ℃，灯丝电流为35 µA，电子能量为70 eV，多反应监测模式(MRM)检测，参数见表1。

表1 4种PAH及2种内标物的MRM参数Table 1 MRM Parameters of 4 PAHs and 2 internal standards

2 结果与讨论

2.1 样品前处理

图1 分子印迹固相萃取柱吸附多环芳烃的效果Fig.1 Recoveries of PAHs on the MIPSPE cartridge

利用GC-MS/MS的高选择、高灵敏性，虽然植物油样品经简单提取即可用于PAH的测定，但样品溶液中残存的甘油酯等基质，能快速降低毛细管色谱柱柱效，缩短使用寿命，并易使离子源受到污染，造成检测异常。去除甘油酯为主体的基质干扰，固相萃取技术是较为方便有效的方法之一。常见商品化萃取小柱有中性氧化铝柱[8]、弗罗里硅土柱[10]、活性炭柱[22]和分子印迹柱[25]。其中，中性氧化铝柱和弗罗里硅土柱是利用其对样品溶液油脂和色素的吸附保留，进行净化，但由于植物油样品的主体为油脂，填料和洗脱溶剂体积用量较大；而活性炭柱和分子印迹柱则是选择吸附待测物，除脂较为完全，洗脱溶剂用量少，操作简单；但活性炭柱大多适用于轻质 PAH，重质 PAH则容易被永久吸附，回收率偏低[22]，而商品化 BAP分子印迹柱（见1.1），除对BAP有选择性保留外，对包括BAA、CHR和BBF在内的几种重质PAH均有满意的选择性保留。见图1，为GB 5009.265-2016中涉及的16种PAH在本实验条件下，BAP分子印迹柱上的保留效果。因此本文选用BAP分子印迹柱进行净化。

植物油样品用正己烷溶解，当流经分子印迹净化柱后，目标物被选择性吸附，再用适量正己烷清洗残留油脂后，目标PAH可通过诱导偶极-偶极相互作用被极性溶剂洗脱，本文选用极性、挥发性适中的二氯甲烷做洗脱溶剂，即容易吹干，又方便控制体积，当洗脱体积为5 mL时4种目标PAH被完全洗脱。为进一步去除复杂植物油样品（如芝麻油）中有机酸、多酚类物质的干扰，分子印迹柱上方与硅胶柱进行串联使用，洗脱前弃去硅胶柱，能更好地去除基质干扰。实验表明，使用BAP分子印迹柱，净化植物油样品，简单有效。

2.2 色谱质谱条件的优化

图2 4种PAH的MRM色谱图Fig.2 MRM chromatograms of 4 PAHs

由于BAA与CHR为同分异构体，BBF与BKF为同分异构体，质谱母离子和子离子相同，无法通过质谱进行区分，因此，必须使BAA与CHR进行有效色谱分离，BBF不受BKF色谱峰的干扰。常用分离PAH的毛细管色谱柱主要有DB-5MS[10]、HP-5MS[11]和DB-EUPAH[22]，其中DB-EUPAH为PAH专用柱，适于分离较多种PAH。本研究由于只测定BAA、CHR、BBF和BAP四种PAH，选择使用DB-5MS毛细管色谱柱，在本实验优化的条件下，BAA与 CHR、BBF与BKF获得了良好分离。质谱参数根据样品基质的干扰情况对母离子、子离子和碰撞能进行了选择和优化，MRM参数及MRM色谱图分别见表1和图2。

2.3 检出限(LOD)、定量限(LOQ)、线性、准确度和精密度

LOD和LOQ分别是目标物定量离子色谱峰不小于3倍和10倍的信噪比(Peak to Peak)，且定性离子色谱峰可有效识别，通过对适当浓度标准溶液、实际样品和空白加标样进行测定进行评估，结果见表 2。仪器 LOD 为 0.03~0.09 µg/L，LOQ 为 0.13~0.29 µg/L，方法LOD为0.26~0.49 µg/kg，LOQ为0.86~1.63 µg/kg，能满足4种欧盟限量PAH监测的需要；在1~50 µg/L浓度范围内，各目标物均有良好的线性，R2>0.999，详见表2；对食用油样品进行5、10和20 µg/kg三个水平的加标回收实验，每个添加水平重复测定6次，回收率为 81.06~111.30%，相对标准偏差(RSD)为0.86~5.65%，详见表3。

表2 4种PAH的线性、检出限与定量限Table 2 Linearity, LOD and LOQ of 4 PAHs

表3 4种PAH的回收率(R)和精密度(RSD)(n=6)Table 3 Recovery rate (R) and relative standard deviation (RSD) of 4 PAHs (n=6)

2.4 实际样品的分析

采用上述所建立的方法，对26个市售食用植物油进行分析，每个样品重复测定两次，结果见表 4。由表4可知，4种PAH均有检出；其中，BAP的含量为2.04~6.16 µg/kg，低于我国食用油国家标准限量[4]，但超出欧盟限量[5](超标率为 100%)。BAA 含量为2.22~7.38 µg/kg，CHR 含量为 2.72~10.90 µg/kg，BBF含量为 2.38~7.58 µg/kg，PAH4总含量为 9.36~31.38µg/kg，其中23个市售食用植物油的4种PAH总含量超出欧盟限量[5](超标率为88.46%)。监测的6种油品间，PAH4平均含量相对较高的是芝麻油、花生油和葵花油，较低的是大豆油、玉米油和调和油。依相关食品安全国家标准，我国食用油中的 PAH处于安全水平，但较欧盟限量而言，我国食用植物油的安全质量还存在较大差距，有待一步的提高。

表4 实际样品中4种PAH的含量(µg/kg)Table 4 The contents of 4 PAHs in edible vegetable oil samples (µg/kg)

3 结论

本研究建立了分子印迹固相萃取除脂，GC-MS/MS检测食用植物油中4种欧盟限量PAH的新方法。该方法具有简单、快速、准确且经济实用的优点，能满足对食用油中4种欧盟限量PAH监测的需要。

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