Taqman探针荧光PCR法检测食品中的大肠埃希氏菌O145

游淑珠，唐食明，蔡教英，姚丽锋，王小玉，冯家望，丁琦，符家忍

（珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心，广东珠海 519000）

大肠埃希氏菌（Escherichia coli）为人和温血动物肠道正常栖居菌，绝大部分大肠埃希氏菌在正常栖居条件下不致病，若侵入组织或血液时可引起化脓性炎症或败血症，可引发体弱或免疫力低下人群或动物感染。有些大肠埃希氏菌为食源性致病菌，能引起人类以腹泻症状为主的病症，这些大肠埃希氏菌被统称为致泻性大肠埃希氏菌（diarrheagenic E. coli，DEC）。致泻性大肠埃希氏菌可分为：肠道致病性大肠埃希氏菌（enteropathogenic E. coli，EPEC）、肠道侵袭性大肠埃希氏菌（enteroinvasive E. coli，EIEC）、产肠毒素大肠埃希氏菌（enterotoxigenic E. coli，ETEC）、肠道集聚性大肠埃希氏菌（enteroaggregative E. coli，EAggEC）、扩散附着大肠埃希氏菌（diffusely adherent E. coli，DAEC）和产志贺毒素大肠埃希氏菌为（shigatoxin-producingE. coli，STEC）六大类[1]。部分产志贺毒素大肠埃希氏菌属于肠道出血性大肠埃希氏菌（enterohemorrhagicE. coli，EHEC）可引起人类出血性结肠炎或出血性腹泻、溶血性尿毒综合症等临床症状。

致泻性大肠埃希氏菌与特定血清型有一定相关性，《伯杰氏系统细菌学手册》列出了已发现的EPEC、ETEC、EIEC、EAggEC和STEC五种致泻大肠埃希氏菌的所有相关血清型，其中大肠埃希氏菌O145血清型与 EPEC、STEC相关[1,2]。从临床病人和温血动物中均有分离大肠埃希氏菌O145的致病性菌株的相关报道[3～7]，1984年日本首次报道大肠埃希氏菌O145导致的食源性疾病暴发事件以来，美国、德国、比利时等许多国家都报道过大肠埃希氏菌O145引起的食源性疾病暴发事件[6～8]，其中2010年美国密歇根、俄亥俄和纽约等5个州暴发的因食用被污染长叶生菜的重大食源性疾病事件的病原体也被认定为大肠埃希氏菌O145[7]。

大肠埃希氏菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K），其中O抗原是血清分型的基础，共有一百七十多种[1]。由于分型用血清售价高、保质期短，加上大肠埃希氏菌污染较普遍等特点，导致传统分离、生化和血清分型鉴定方法存在检测时间长、鉴定过程工作量大、检测费用居高不下等无法避免的缺点，在实际应用中大大受限。O抗原由O抗原基因簇编码，随着对O抗原基因簇编码基因研究的深入，以为PCR代表的现代分子生物学新技术以其无可取代的优势被广泛用于微生物检测领域，也同样被成功应用大肠埃希氏菌O145血清型的检测[8～11]。Taqman探针荧光PCR法是利用PCR反应延伸过程中，Taq酶的5’核酸外切酶活性切割与靶序列结合的寡核苷酸探针，使得Taqman探针的报告基团与淬灭基团分离而产生荧光强度变化的一种 PCR技术，与 SYBR green染料荧光 PCR法以及传统的PCR扩增加电泳检测相比，Taqman探针的引入提升了反应的特异性，该技术实行完全闭管式操作，不仅避免了传统PCR开盖引起的产物污染问题，减少了假阳性现象的出现，还避免了对环境的污染[12]，扩增反应全程动态实时可见，是一种高特异性、高灵敏度、快速高通量的现代分子生物学检测技术，本世纪以来已被逐步推广应用于生物学研究、食品检测、环境检测、医学检测与诊断等行业。

本研究以大肠埃希氏菌O145为检测对象针对其O抗原基因簇的wckD基因建立了Taqman荧光PCR检测方法，验证了方法的灵敏度和特异性，并将其用于食品中大肠埃希氏菌O145的快速检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

28株大肠埃希氏菌细菌和20株非大肠埃希氏菌细菌，分别来源于美国典型菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，英国国家典型菌株保藏中心（National Collection of Type Cultures，NCTC），中国医学微生物菌种保藏管理中心(National Center for Medical Culture Collection，CMCC)，中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，黑龙江出入境检验检疫局和珠海出入境检验检疫局。

表1 实验用菌株Table 1 Strains used in theexperiment

大肠埃希氏菌 A T C C 4 3 8 9 3 O 1 2 4 金黄色葡萄球菌 C M C C(B)2 6 0 0 3 /大肠埃希氏菌 A T C C 3 5 1 5 0 O 1 5 7 表皮葡萄球菌 C M C C(B)2 6 0 6 9 /大肠埃希氏菌 A T C C 7 0 0 0 7 8 / 藤黄微球菌 C M C C(B)2 8 0 0 1 /大肠埃希氏菌 A T C C 1 0 7 9 8 / 铜绿假单孢菌 C C T C C A B 9 1 0 9 5 /大肠埃希氏菌 A T C C 1 3 7 0 6 / 肺炎克雷伯氏菌 C M C C 4 6 1 0 1 /大肠埃希氏菌 A T C C 1 5 5 9 7 / 肠炎沙门氏菌 C C T C C A B 9 4 0 1 8 /大肠埃希氏菌 A T C C 1 1 2 2 9 / 福氏志贺氏菌 C M C C 5 1 5 7 1 /大肠埃希氏菌 N C T C 1 2 9 0 0 O 1 5 7 宋内氏志贺氏菌 C M C C 5 1 3 3 4 /大肠埃希氏菌 C C T C C A B 2 0 0 0 5 1 O 1 5 7 副溶血性弧菌 A T C C 1 7 8 0 2 /大肠埃希氏菌 C C T C C A B 2 0 0 0 6 8 / 乙型溶血性链球菌 C M C C(B) 3 2 2 1 0 /大肠埃希氏菌 C M C C(B)4 4 1 0 2 / 枯草芽孢杆菌 C M C C(B)6 3 5 0 1 /大肠埃希氏菌 E C O 4 O 4 产气荚膜梭菌 A T C C 1 3 1 2 4 /大肠埃希氏菌 E C O 1 0 4 O 1 0 4 粪肠球菌 C M C C(B) 3 2 2 2 0 /大肠埃希氏菌 E C O 1 5 7-1 O 1 5 7 小肠结肠炎耶尔森氏菌 C M C C(B) 5 2 2 0 4 /大肠埃希氏菌 E C O 1 5 7-2 O 1 5 7 变形杆菌 C M C C(B) 4 9 0 2 7 /

1.1.2 培养基、试剂与溶液

离子柱型DNA提取试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司；DEPC水：生工生物工程（上海）股份有限公司；EC肉汤：北京陆桥技术股份有限公司；Premix Ex Taq（Probe qPCR）试剂盒、DNA Marker：宝生物工程（大连）有限公司；DNA裂解液：珠海科登生物工程有限公司。

1.1.3 引物和探针

在NCBI网站上检索的不同菌株来源的大肠埃希氏菌O145的O抗原基因簇序列（GenBank序列号：AY863412、AY647260、 JN850039～JN850044），DNAMAN软件比对，根据wckD基因高保守区的基因序列，通过Oligo7.0软件设计引物、Taqman探针。上游引物：5′-CTGTGATTCAGAACTAGAAG-3′；下游引物：5′-GCCACTACTACATTGTCA-3′；探针：5′-FAM-TCACGAATAACTACAGAACCAGAACCABHQ1-3′：上海英潍捷基公司合成。引物对和探针分别用DEPC水稀释至储备浓度100 μmol/L，-20 ℃保存，临用时用DEPC水稀释至工作浓度10 μmol/L。

1.1.4 食品样品

畜肉196份、水产品46份、禽产品43份、可生食蔬菜54份：部分购自珠海本地集贸市场、超市；部分为本单位受理的委托检验样品。

1.2 主要仪器设备

NanoDropND-1000核酸浓度测定仪：美国赛默飞世尔公司；Minispin Plus离心机：德国艾本德公司；7500Fast荧光PCR仪：美国美国应用生物系统公司；AES easyMIX拍击式均质器：法国生物梅里埃公司；1565-2E恒温培养箱，美国SHELLAB公司。

1.3 试验方法

1.3.1 细菌 DNA模板的制备、浓度和纯度测定

各菌株指数生长期新鲜培养物，用DNA提取试剂盒并按其说明提取制备DNA模板。核酸浓度测定仪测定出 DNA浓度与纯度，OD260/OD280比值在1.6～1.9之间表明DNA纯度较高，可用于PCR扩增。

1.3.2 荧光PCR反应体系和反应条件

反应体系：总体积 25 µL：Premix（2×）12.5 μL、引物对（10 μmol/L）1 µL、探针（10 μmol/L）1 µL、50×ROX Reference Dye I（I50×）0.5 µL、DEPC水8 µL、模板2 µL。每个反应管均设置双平行管。空白对照以DEPC水代替模板。

反应条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，收集荧光，40个循环。

1.3.3 特异性试验

各菌株DNA模板均按1.3.2进行荧光PCR扩增，验证荧光PCR方法的特异性。

1.3.4 灵敏度试验

将大肠埃希氏菌O145的DNA进行10倍梯度稀释至10-7浓度，将DNA原液和核酸梯度稀释液相同条件进行荧光PCR扩增，确定荧光PCR方法的灵敏度。

1.3.5 食品样品的检测

1.3.5.1 样品制备和均质

无菌称取样品25 g至有滤网的拍击式均质袋，加入225 mL无菌EC肉汤，拍击式均质器均质2 min。

1.3.5.2 样品增菌

36 ℃恒温培养箱培养24 h。

1.3.5.3 样品核酸提取

拍击式均质袋中取1 mL增菌液的滤过液，12000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀加50 µL DNA裂解液，100 ℃金属浴5 min，冷却，12000 r/min离心5 min，上清用于荧光PCR检测。

1.3.5.4 样品荧光PCR检测

同1.3.2中的条件进行荧光PCR检测。

2 结果与讨论

2.1 Taqman探针荧光PCR检测方法的建立

图1 大肠埃希氏菌O145扩增曲线Fig.1 Amplification plot of Escherichia coli O145

选择大肠埃希氏菌O145的O抗原基因簇中wckD基因为靶基因，设计引物、探针，通过反应体系和反应条件优化，建立了大肠埃希氏菌 O145的 Taqman探针荧光PCR检测方法，大肠埃希氏菌O145菌株呈现出典型的荧光PCR扩增曲线（见图1），表明该反应体系适用于大肠埃希氏菌O145的扩增。

2.2 特异性试验

图2 大肠埃希氏菌O145特异性试验扩增曲线Fig.2 Amplification plot of specificity test of Escherichia coli O145

表1所列菌株用建立的Taqman探针荧光PCR法进行扩增，以验证方法的特异性，验证结果表明，仅大肠埃希氏菌O145菌株呈现出典型的荧光PCR扩增曲线（见图2），其它27株大肠埃希氏菌和20株非大肠埃希氏菌菌株的DNA样本的检测结果均为阴性。据此可判断，本研究中针对大肠埃希氏菌O145的引物和Taqman探针特异性良好。

2.3 灵敏度试验

图3 大肠埃希氏菌O145灵敏度试验扩增曲线Fig.3 Amplification plot of sensitivity test of Escherichia coli O145

核酸浓度测定仪测定大肠埃希氏菌O145菌株的DNA浓度为33 ng/µL，菌株DNA原液和10倍递增稀释液扩增曲线见图3，每个反应模板加入量为2 µL，图中可见大肠埃希氏菌O145菌株的DNA原液（66 ng/反应）、10-1稀释液（6.6 ng/反应）、10-2稀释液（660 pg/反应）、10-3稀释液（66 pg/反应）、10-4稀释液（6.6 pg/反应）、10-5稀释液（0.66 pg/反应）均有明显扩增曲线出现，且各稀释度平行试验重复性良好，因此可计算、判断本方法检测灵敏度为0.66 pg/反应，大肠埃希氏菌基因组为0.004 pg/拷贝，灵敏度折算即165拷贝/反应。

2.4 食品样品污染调查

所检339份食品样品中检出大肠埃希氏菌 O145阳性31份，阳性率9.1%，各类型样品阳性率见表2。由表2结合样品来源分析可知，生畜肉均为购自市场和超市的生猪肉和生牛肉，未经过食品深加工，196份样品检出样品大肠埃希氏菌O145阳性样品27份，阳性率最高达13.8%；水产品、禽产品和可生食蔬菜多数为经过加工的产品，特别是部分水产品和禽产品为深度加工的鲜、冻产品，阳性率较低，46份水产品、禽产品43份各检出样品大肠埃希氏菌O145阳性1份，阳性率分别为2.2%和2.3%；54份可生食蔬菜检出大肠埃希氏菌O145阳性2份，阳性率为3.7%。检测结果表，食品基质营养越丰富、未经过加工或只经过初加工的产品阳性率相对较高，经深加工的产品阳性率相对较低，样品检出阳性率与食品基质类型及其加工程度存在一定相关性。

表2 食品样品污染调查结果统计分析Table 2 Statisticsanalysis of food samples pollution survey

3 结论

3.1 Taqman探针荧光PCR技术具有快速、简便、灵敏等优点，与SYBR green染料荧光PCR法以及传统的PCR扩增加电泳检测相比，Taqman探针的引入提升了反应的特异性，使其特异性更强、自动化程度更高，扩增反应全程动态实时可见，PCR扩增过程无需对PCR扩增产物进行后处理，完全闭管式操作，可有效解决PCR产物污染导致的假阳性等问题，已成为检测领域重要的快速高通量检测手段。

3.2 本研究中设计的引物和Taqman探针可实现对大肠埃希氏菌 O145菌株的特异性扩增，其它 27株非O145大肠埃希氏菌和20株非大肠埃希氏菌细菌菌株均无扩增，说明引物和探针具有高度特异性。为确定该方法检测灵敏度，对已知浓度的大肠埃希氏菌O145核酸进行10倍梯度稀释，进行实时荧光PCR检测，结果显示，原始菌液稀释至10-5时仍能检出，表明本方法对检测灵敏度为0.66 pg/反应（即165拷贝/反应）。

3.3 食品中食源性致病菌往往含量不高，食品样品采用EC肉汤增菌培养物进行实时荧光PCR进行检测，其原理是利用细菌在指数增长期遵循的数学指数模型以提高检测的灵敏度、准确度和可靠性，便于简化DNA提取步骤、减少非活致病菌的干扰，避免死的目标菌导致的假阳性产生，样品增菌并用增菌液的滤过液进行实时荧光 PCR检测可避免肉类等复杂基质可能导致的假阴性产生。食品样品DNA的提取采用的热裂解法操作简便、快速、经济节约，便于大批量样品的检测。

3.4 本研究建立的Taqman探针荧光PCR方法全过程（包括样品增菌、核酸提取、荧光PCR扩增反应和结果分析）用于食品中大肠埃希氏菌O145的检测仅需约28 h，样品增菌后的核酸提取和检测所需时间仅2 h～3 h，与传统细菌分离鉴定方法增菌后分离、生化和血清鉴定至少需3 d～7 d相比显著缩短了检测时间。综上所述，方法的特异性、灵敏度和实际样品污染调查试验表明，本研究建立的荧光PCR快速检测方法特异性强、灵敏度高、快速、操作简便，可用于食品中大肠埃希氏菌O145的快速检测。

[1]Don J Brenner, Noel R Krieg, James T Staley, et al. Bergey's Manual® of Systematic Bacteriology：Volume2：The Proteobacteria, PartB：The Gammaproteobacteria [M]. New York：Springer, 2005

[2]GB 4789.6-2016,食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验[S]GB 4789.6-2016, National Food safety Standard Microbiological Examination of Food-Examination of Diarrheogenic Escherichia coli. [S]

[3]Kaftyreva L A, Makarova M A, Konovalova T A, et al.Characteristics of enterohemorrhagic Escherichia coli O145：H28 isolated from a patient with hemolytic-uremic syndrome [J]. Zhurnal Mikrobiologii Epidemiologii I Immunobiologii, 2013, 5：100-104

[4]Rumi M V, Irino K, Deza N, et al. First isolation in Argentina of a highly virulent Shiga toxin-producing Escherichia coli O145：NM from a domestic cat [J]. Journal of Infection in Developing Countries, 2012, 6(4)：358-363

[5]Sonntag A K, Prager R, Bielaszewska M, et al. Phenotypic and genotypic analyses of enterohemorrhagic Escherichia coli O145 strains from patients in Germany [J]. Journal of Clinical Microbiology, 2004, 42(3)：954-962

[6]De Schrijver K, G Buvens, B Posse, et al. Outbreak of verocytotoxin-producing E. coli O145 and O26 infections associated with the consumption of icecream produced at a farm, Belgium [J]. Euro. Surveillance, 2008, 13(7)：61-64

[7]Taylor E V, Nguyen T A, Machesky K D, et al. Multistate outbreak of Escherichia coli O145 infections associated with romaine lettuce consumption, 2010 [J]. Journal of Protection,2013, 76(6)：939-944

[8]Fratamico P M, Deb Roy C, Miyamoto T, et al. PCR detection of enterohemorrhagic Escherichia coli O145 in food by targeting genes in the E.coli O145 O-antigen gene cluster and the shiga toxin 1 and shiga toxin 2 genes [J].Foodborne Pathogens & Disease, 2009, 6(5)：605-611

[9]Cooper K K, Mandrell R E, Louie J W. Comparative genomics of enterohemorrhagic Escherichia coli O145：H28 demonstrates a common evolutionary lineage with Escherichia coli O157：H7 [J]. BMC Genomics, 2014, 15：17

[10]Perelle S, Dilasser F, Grout J, et al. Development of a 5'-nuclease PCR assay for detecting Shiga toxin-producing Escherichia coli O145 based on the identification of an'O-island 29' homologue [J]. Journal of Apply Microbiology,2003, 94(4)：587-594

[11]Feng L, Senchenkova S N, Tao J, et al. Structural and genetic characterization of enterohemorrhagic Escherichia coli O145O antigen and development of an O145 serogroupspecific PCR assay [J]. Journal of Bacteriology, 2005, 187(2)：758-764

[12]姜文灿,岳素文,江洪,等.TaqMan探针法实时荧光定量PCR的应用和研究进展.[J]临床检验杂志,2015,4(1)：797-805 JIANG Wen-can, YUE Su-wen, JIANG Hong, et al.Applicationand research progressof TaqMan probe real time PCR [J]. Clinical Laboratory Journal, 2015, 4(1)：797-805