宁夏地区牛源产与非产ESBLs大肠埃希氏菌耐药性差异比较

高海慧，黎玉琼，汪 洁，扈宁霞，王培柱，吴学青，康晓冬*

(1.宁夏农林科学院动物科学研究所，银川 750002；2.陕西榆林市绥德县名州区农牧业综合服务站，绥德 718000；3.宁夏吴忠市利通区扁担沟镇畜牧兽医工作站，吴忠 751100)

大肠埃希氏菌(Escherichiacoli,E.coli)为条件性致病菌，在一定条件下可单独感染或者同其他致病菌混合感染引起发病。大肠埃希氏菌的血清型复杂，毒力基因种类多且经常同时携带多种毒力基因，防控和治疗任务艰巨。目前，在奶牛肉牛养殖中，抗生素是治疗该病的首选药物，宁夏回族自治区牛对阿米卡星敏感性最高[1]。超广谱β-内酰胺酶(extend spectrum β-lactamase,ESBLs)是一种可以为大肠埃希氏菌提供多种β-内酰胺类抗菌药物的水解酶[2]，可以通过转化、转导和接合等形式在细菌中传播扩散耐药基因，是细菌对β-内酰胺类抗菌药物的主要耐药机制[3]。国际上研究认为ESBLs是较为活跃的β-内酰胺酶，尤其是在肠杆菌科细菌中起到较为重要的作用[4]。不同国家、地区兽医用药习惯、剂量不同，使得不同国家、地区基因型和基因亚型也存在差异。奶牛和肉牛是我区畜牧业重要的支柱产业，肉牛又是南部山区脱贫攻坚的主力军，本研究开展牛源产ESBLs大肠埃希氏菌筛选、耐药性比较，为牛源产ESBLs大肠埃希氏菌在我区感染和流行提供资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本 于2017年10月至2020年10月采集宁夏地区规模化牛场健康源肛拭子120份，腹泻源牛肛拭子157株，离心管收集，冰袋运输。

1.1.2 药品 ESBLs测定盒[头孢他定(CAZ)、头孢噻肟(CTX)、头孢他定/克拉维酸(CAZ/clav))、头孢噻肟/克拉维酸(CTX/clav)]，本着经济、有效、广谱、安全的原则，选用临床常用抗菌药物21种，具体如下：头孢拉定(先锋VI，30 μg/片，批号200513)，头孢呋辛(30 μg/片，批号200525)，链霉素(10 μg/片，批号200524)，复方新诺明(23.78 μg SMZ/1.25 μg TM/片，200508)，红霉素(15 μg/片，批号200520)，卡那霉素(30 μg/片，批号200513)，哌拉西林(100 μg/片，批号200607)，头孢氨苄(头胞力新，30 μg/片，批号200515)，四环素(30 μg/片，批号200515)，诺氟沙星(10 μg/片，批号200511)，头孢噻肟(30 μg/片，批号200602)，环丙沙星(5 μg/片，批号200517)，头孢唑啉(30 μg/片，批号200603)，庆大霉素(10 μg±2.5 μg/片，批号200513)，头孢曲松(30 μg/片，批号200530)，阿米卡星(30 μg±7.5 μg/片，批号200609)，恩诺沙星(5 μg/片，批号200523)，氧氟沙星(5 μg/片，批号200605)，阿莫西林(10 μg/片，批号200517)，氨苄西林(10 μg/片，批号200527)，头孢他啶(30 μg/片，批号200529)等，杭州滨和微生物试剂有限公司产品。

1.1.3 主要试剂 麦康凯培养基MAC(批号161119)、伊红美蓝琼脂培养基(EMB)(批号161020)、MH 琼脂培养基 (批号161021)，青岛海博生物技术有限公司产品；4.5 g/L NaCl溶液，法国梅里埃公司产品；细菌基因组DNA提取试剂盒、2×TaqPCR MasterMix、MarkerⅠ，天根生化科技(北京)有限公司产品。

1.1.4 主要仪器 全自动微生物鉴定系统(VITEK-2-Compact15)，法国梅里埃公司产品；PCR仪，美国Bio-Rad公司产品；超净工作台(SW-CJ-1FD)，苏净集团安泰公司产品；电子比浊仪(DensiCHEK Plus)，美国 BioMerieux公司产品；电热恒温培养箱(PHP-9162)，浙江托普仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 大肠埃希氏菌的分离鉴定 将肛拭子于营养肉汤中37℃过夜培养，培养物接种于EMB、MAC，培养16 h～24 h，镜检纯化，VITEK 2 Compact进行菌种鉴定，挑选鉴定为阳性的大肠埃希氏菌进行16S rRNA鉴定[1]，引物序列见表1。

表1 基因检测引物序列及大小Table 1 Primer sequences and fragment size of gene detection

1.2.2 大肠埃希氏菌ESBLs筛选 用麦氏比浊仪调整菌液浓度为0.5个麦氏单位，接种于MH平板上，均匀涂布，采用双纸片协同法，贴ESBLs测定盒中的CTX(30 μg)、CTX/CLA(30 μg/10 μg)，CAZ(30 μg)、CAZ/CAL(30 μg/10 μg)两组于平板，37℃过夜培养，比较加入克拉维酸与不加克拉维酸的抑菌直径≥5 mm者判定为产ESBLs菌株。

1.2.3 耐药性试验 试验采用K-B法进行，确定大肠埃希氏菌的药物敏感性，结果按照临床实验室标准化委员会(CLSI)标准判定。

2 结果

2.1 大肠埃希氏菌的分离鉴定

277份肛拭子样本中分离到142株大肠埃希氏菌，阳性率51.26%，分离株在EMB上呈具有黑色金属光泽菌落，在MAC上呈圆形、突起光滑、湿润的粉色菌落，纯化菌株经VITEK 2 Compact鉴定为大肠埃希氏菌。

2.2 大肠埃希氏菌的16S rRNA鉴定

扩增2.1中鉴定株的16S rRNA基因，符合目的条带的部分产物送测序，经Blast比对确定为大肠埃希氏菌。

2.3 ESBLs检测结果

抑菌圈直径分析显示，腹泻源性74株大肠埃希氏菌有51株为产ESBLs菌株，23株为非产ESBLs菌株，阳性率为68.92%。非腹泻源68株大肠埃希氏菌有35株为产ESBLs菌株，33株为非产ESBLs菌株，阳性率为51.47%。

2.4 药敏试验结果

2.4.1 74株腹泻源大肠埃希氏菌药敏试验结果 74株腹泻源大肠埃希氏菌对试验药物多数呈耐药状态，对阿米卡星和头孢他啶较敏感，产ESBLs株耐药率普遍高于非产ESBLs株，产ESBLs与非产ESBLs株对阿米卡星耐药率分别为15.69%和4.35%，头孢他啶耐药率分别为11.76%和4.35%，差异不显著(P>0.5)，对其他药物耐药率高，差异不显著(P>0.5)，具体见表2和表3。

2.4.2 68株健康源大肠埃希氏菌药敏试验结果 68株健康源大肠埃希氏菌耐药率整体低于腹泻源大肠埃希氏菌，对阿米卡星和头孢呋辛较敏感，产ESBLs株耐药率均高于非产ESBLs株，产ESBLs与非产ESBLs株对头孢氨苄耐药率分别为81.82%和17.14%，差异显著(P<0.05)；对头孢呋辛耐药率分别为21.21%和0，对卡那霉素分别为63.64%和20.00%，对红霉素分别为63.64%和14.29%，对其他药物均耐药率较高，但差异不显著(P>0.05)，具体见表2和表3。

M.DNA MarkerⅠ；1.阴性对照；2～8.分离株PCR产物M.DNA MarkerⅠ;1.Negative control;2-8.PCR products of isolates图1 16S rRNA PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of 16S rRNA

表2 产ESBLs大肠埃希氏菌药敏试验结果Table 2 Results of drug susceptibility test of Escherichia coli producing ESBLs strains

表3 非产ESBLs大肠埃希氏菌药敏试验结果Table 3 Results of drug susceptibility test of Escherichia coli non-producing ESBLs strains

2.4.3 产ESBLs与非产ESBLs株药敏试验结果 产ESBLs株对头孢他啶耐药率中，腹泻源性大肠埃希氏菌极显著低于健康源大肠埃希氏菌(P<0.01)，非产ESBLs株对头孢氨苄、红霉素耐药率中，腹泻源性大肠埃希氏菌显著高于健康源大肠埃希氏菌(P<0.05)，对头孢呋辛耐药率中，腹泻源性大肠埃希氏菌极显著高于健康源大肠埃希氏菌(P<0.01)。

2.5 多重耐药结果

10重耐药以上产ESBLs大肠埃希氏菌中，腹泻源极显著高于健康源(P<0.01)，腹泻源多重耐药为10耐及以上，1株为全部耐药，健康源多重耐药为2耐及以上，无全部耐药。非产ESBLs大肠埃希氏菌中，腹泻源5株为19重耐药，健康源无19重耐药，健康源中3株不存在耐药情况，1株为非耐药株。产ESBLs大肠埃希氏菌多重耐药率高于非产ESBLs大肠埃希氏菌，但差异不显著(P>0.05)，具体见表4和表5。分离株多重耐药情况严重，腹泻源产ESBLs大肠埃希氏菌耐药情况最严重。

表4 产ESBLs大肠埃希氏菌多重耐药情况Table 4 Multiple drug resistance of Escherichia coli producing ESBLs strains

表5 非产ESBLs大肠埃希氏菌多重耐药情况Table 5 Multiple drug resistance of Escherichia coli non-producing ESBLs strains

3 讨论

大肠埃希氏菌是肠道正常菌群，维护肠道健康，使细菌耐药基因产生、传递、转移更加方便[5]。随着对抗生素的广泛使用，多重耐药菌及耐药基因急剧增长，对公共卫生安全构成威胁。ESBLs主要由肠杆菌科产生，由质粒介导，编码ESBLs酶的基因可通过转化、转导、接合、整合等途径扩散到细菌中，使大肠埃希氏菌对新型广谱 β-内酰胺类抗生素耐药性增加[6-7]。对分离自宁夏地区277株牛源大肠埃希氏菌进行ESBLs表型检测，腹泻源与健康源产ESBLs菌株阳性率分别为68.92%和51.47%，均高于四川省禽源大肠埃希氏菌产ESBLs菌株检出率(36.83%)[8]，高于广东省食品动物(鸡、鸭、鹅和猪)中大肠埃希氏菌产ESBLs菌株的检出率(19.37%)[9]，低于青岛鸡源大肠埃希氏菌产ESBLs菌株检出率(93.13%)[10]，低于虎源大肠埃希氏菌产ESBLs菌株检出率(70.00%)[11]。不同畜种、来源、地区，大肠埃希氏菌产ESBLs菌株的流行分布存在差异，且宁夏地区牛源产ESBLs大肠埃希氏菌在宁夏地区牛养殖场中流行普遍，需要引起重视。

研究发现产ESBLs株、非产ESBLs株中腹泻源性、健康源大肠埃希氏菌药物敏感性存在差异。

产ESBLs株对头孢他啶耐药率中，腹泻源性大肠埃希氏菌极显著低于健康源大肠埃希氏菌(P<0.01)。非产ESBLs株对头孢呋辛耐药率中，腹泻源性大肠埃希氏菌极显著高于健康源大肠埃希氏菌(P<0.01)，非产ESBLs株对头孢氨苄、红霉素耐药率中，腹泻源性大肠埃希氏菌显著高于健康源大肠埃希氏菌(P<0.05)。分离菌株长期处于多种抗生素的选择压力下，不同地区、不同管理模式均会影响药物敏感性，导致产ESBLs株、非产ESBLs、腹泻源、健康源大肠埃希氏菌耐药情况复杂。

本研究中腹泻源产ESBLs菌株的耐药性普遍高于非产ESBLs菌株，腹泻源产ESBLs株对其他药物耐药率均大于54.80%,非产ESBLs株对其他药物耐药率均大于47.80%，但差异不显著(P>0.05)。对阿米卡星、头孢他啶较敏感。史量全等[12]发现通辽地区牛腹泻大肠埃希氏菌对阿米卡星、哌拉西林、亚胺培南、美洛培能敏感，王理想[13]试验表明腹泻牛脏器源大肠埃希氏菌对左氧氟沙星、庆大霉素敏感。健康源产ESBLs菌株的耐药性明显高于非产ESBLs菌株，分离株对阿米卡星、头孢呋辛较敏感。对头孢氨苄耐药率分别为81.82%和17.14%，差异显著(P<0.05)，其他药物均差异不显著(P>0.05)。坤清芳等[14]研究发现兔源产ESBLs大肠埃希氏菌对头孢他啶、阿米卡星、头孢西丁、头孢唑啉和诺氟沙星的耐药率显著高于非产ESBLs菌株。腹泻源与健康源产ESBLs株耐药率水平基本相当，腹泻源非产ESBLs株耐药率高于健康源非产ESBLs株。ESBLs是介导大肠埃希氏菌对β-内酰胺类药物耐药的主要因素[15]，编码ESBLs酶的基因可以与其他非ESBLs酶耐药基因整合于同一质粒，将耐药基因进行传播[14,16]，不同地区、不同畜种、不同养殖规模、不同生产管理条件都会影响耐药基因的表达。

产酶菌株对头孢噻肟等抗菌药物的耐药率均高于非产酶菌株[17]，80.60% 的产ESBLs菌株表现多重耐药现象[18]。本研究中产ESBLs菌株多重耐药率高于非产ESBLs菌株，研究结果一致。本研究显示产ESBLs大肠埃希氏菌中，腹泻源多重耐药为10耐及以上，1株为全部耐药，健康源多重耐药10耐及以上占比77.14%，无全部耐药，腹泻源极显著高于健康源(P<0.01)。非产ESBLs大肠埃希氏菌中，腹泻源5株为19重耐药，健康源无19重耐药，3株为单重耐药，1株为非耐药。可能腹泻源性大肠埃希氏菌中部分为致病菌，毒力水平和耐药水平较高，分离株多重耐药现象普遍存在，腹泻源产ESBLs大肠埃希氏菌耐药情况最严重。药物的广泛应用及新抗菌药物的临床应用，使得大肠埃希氏菌产ESBLs酶株越来越多，多重耐药现象越来越复杂，应该引起更多的关注。

宁夏地区牛源产ESBLs大肠埃希氏菌检出率高，多重耐药现象严重，尤其是腹泻牛，提示宁夏地区牛场中产ESBLs菌株流行普遍。牛是耐药大肠埃希氏菌的重要宿主，ESBLs酶编码基因常常存在于质粒、转座子或整合子等可移动元件上，可以通过食用牛奶、牛肉等方式传递给人类，有重要公共卫生意义，应定期开展ESBLs水平监测，平时治疗时减少抗生素的使用。