微生物预处理能源草转化生物能源的研究进展

郑玉龙，李淑颖，庞帝琼，杨富裕,4*

(1.中国农业大学 动物科技学院，北京 100193；2.吉林农业大学 动物科学技术学院，吉林 长春 130118；3.北京助尔生物科学研究院，北京 100085；4.国家能源非粮生物质原料研发中心，北京 100193)

能源在人类社会生存与发展中占有重要地位，是各国经济发展的基础。随着世界人口增加与工业发展，化石能源日趋枯竭，按目前探明的储量与开采能力测算，世界范围内的煤碳、 石油和天然气的可采年限分别为230、45和61年[1-2]，因此，必须寻找能够逐步替代化石燃料的新型能源。生物质能源具有可再生性、环保性、资源丰富性以及可替代性，可在很大程度上缓解能源与环境问题[3-5]。能源植物是一种物种丰富、绿色清洁、可大面积种植的生物质资源[6-7]，其中草本能源植物被认为堪当未来生物质能源之大任[8]。能源草是一系列可以作为燃料使用及用作能源生产的草类植物的统称[9-10]，一般是两年生或多年生高大的丛生草本植物或半灌木、灌木，主要由纤维素、半纤维素和木质素等成分组成[11]。能源草可通过糖化发酵转化为乙醇或者厌氧发酵生产沼气等生物质能源，但直接转化的效率不高[12-14]。例如酶法水解玉米秸秆获得的糖产量较低，不超过20 %[15]，因此需要对其进行预处理，以降低纤维素的结晶度、降解木质素、增加纤维素酶系与纤维素的有效接触，提高酶解效率[16-17]。而传统的物理或者化学预处理方法耗能高、易产生发酵抑制物且需要昂贵的抗腐蚀反应器。微生物预处理是一种可以替代物理和化学方法的技术，具有技术简单、耗能少、不产生或很少产生废液与发酵抑制物等优点，研究前景广阔[18-19]。

1 降解能源草的微生物和酶

1.1微生物种类

自然界中能够降解能源草的微生物分布广泛，包括具有木质素降解能力的真菌(褐腐菌、白腐菌和软腐菌等)，还有部分细菌和放线菌。微生物预处理过程会造成大量纤维素的损失[18]，而部分白腐菌能优先降解木质素和半纤维素，对木质纤维降解具有高度的选择性，降低了纤维素的损失[20]。因此，白腐真菌被认为是降解木质素最有效的微生物[21-22]。表1列出了预处理能源草的微生物。

表1 微生物预处理对能源草水解和能源转化的影响Table 1 The effect of microbial pretreatment on enzymatic hydrolysis and biofuel production

1) * 根据未处理的柳枝稷计算得到的理论糖产量* according to the untreated switchgrass calculated the theory of sugar production

由表1可见，预处理能源草的微生物中大部分是白腐真菌，如多孔菌、密孔菌和虫拟蜡菌。能源草转化生物质能源过程中，木质素是酶解和发酵的限制因素，多孔菌[23]、密孔菌[24]和黄孢原毛平革菌[25]对木质素的降解率均达到30 %以上；其中，密孔菌是一种选择性真菌，预处理后全纤维素的损失也较低，只有10 %[24]。还有一部分微生物是细菌，如Yang等[31]在腐烂的柳枝稷中筛选分离得到一种新的降解能源草的微生物菌群，用于预处理柳枝稷14 d，半纤维素与纤维素分别降解了73.5 %和67.3 %；经rRNA序列分析表明，微生物菌群为木糖氧化无色杆菌、粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)和拟枝孢镰孢(Fusariumsporotrichioides)3种细菌。木糖氧化无色杆菌在硝基芳烃的降解中起着关键的作用[33]，在Fusarium属中尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)可以水解木质纤维[34-35]，但这3种细菌参与木质纤维降解是首次报道[36]。

复合微生物预处理的效果一般优于单一微生物[37-38]，如Wen等[12]用复合微生物(MC1、 WSD-5和XDC-2)预处理象草21d，木质素、纤维素和半纤维素降解率分别在30 %、30 %和20 %以上，与对照相比产沼气量提高1.3倍以上，用分泌木质素降解酶的真菌和产纤维素酶的细菌混合处理能源草，在取得较好降解效果的同时，预处理时间也大大缩短[39-40]。

能源草收获季节不同，微生物预处理的效果也有所不同，主要原因是植物的化学组成随生长季节变化而变化。Vasco-Correa等[26]用虫拟蜡菌处理春秋收获的芒,结果表明，虫拟蜡菌对春天收获的芒的预处理效果更好，28 d后春天收获的芒的木质素减少了25.7 %，而秋天收获的没有显著变化；厌氧发酵后，春天收获的芒的甲烷产量提高了25 %，秋天收获的甲烷产量反而减少了。能源草青贮经乳酸菌发酵后也可以作为微生物预处理方法来研究[32]。Ambye-Jensen等[41]青贮处理羊茅黑麦草，48 d后羊茅黑麦草纤维素的转化率最高达到69 %。

1.2微生物预处理能源草产生的酶

研究表明，微生物预处理过程中能源草的降解是微生物代谢产生的一系列酶的协同作用,主要表现在酶对木质纤维的降解作用，参与降解的酶主要有木质素降解酶和水解酶。

漆酶(Lac)、木质素过氧化酶(LiP)和锰过氧化物酶(MnP)是微生物分泌的3种主要的木质素降解酶[42]，能够氧化分解木质素和多种木质素类似物[43]。微生物种类不同，对这3种酶的分泌量也有所不同。研究发现，密孔菌能分泌这3种酶[24]；黄孢原毛平革菌分泌LiP和MnP，而不产生Lac[44]；虫拟蜡菌产MnP和Lac，不产LiP[45]。Wan等[29]研究发现虫拟蜡菌预处理柳枝稷、秸秆和木材，在柳枝稷中MnP和Lac都有产生，麦秸中只发现了Lac，而大豆秸秆中没有发现木质素降解酶的存在，表明底物有所不同，微生物所分泌酶的种类也不同；当2种酶都有分泌时，柳枝稷中的Lac活性较高，而对于玉米秸秆和木材来说则MnP活性较高，表明底物有所不同，微生物分泌的酶活性不同。预处理过程中，酶的活性也在不断发生变化，Liu等[24]研究发现，随着培养时间增加，Lac、MnP和LiP这3种酶的活性先增加后降低，且都在54 d时达到了最高，分别为8.8、 2.1和1.6 U/g。

水解酶在木质纤维降解过程中也发挥着至关重要的作用。水解酶主要是一些降解纤维素和半纤维素的酶，如羧甲基纤维素酶和木聚糖酶等[46-47]，它们在为微生物生长和新陈代谢提供更易利用的碳源发挥了重要作用。预处理过程中，微生物所分泌的酶活性随时间而变化，主要原因是底物和培养条件的改变。Yang等[31]用微生物菌群预处理柳枝稷，在预处理过程中，羧甲基纤维素酶的活性随着时间增加而增加，而木聚糖酶活性先增加后降低。Wen等[12]研究3种微生物菌群预处理象草，也检测到较高活性的羧甲基纤维素酶和木聚糖酶的存在，2种酶的活性均先增加后降低。

单一种类的酶或者一种微生物产生的酶降解纤维素的效果可能较差,但多种降解酶同时存在时可能会表现出很强的降解活性[48-49]。因此，在一些研究中使用混合菌进行预处理，往往能够得到完整的降解酶系，达到更好的木质纤维降解效果[50-52]。

2 微生物预处理能源草工艺

2.1影响因素

影响微生物预处理效果的因素较多，基本上能够影响微生物生长和新陈代谢的因子都能对预处理效果产生一定影响。但底物含水量、微生物接种量、预处理时间和温度是影响微生物预处理能源草效果的主要因素，表2列出了微生物预处理能源草时，几种因素的最适添加条件以及产生的降解效果。在最适合的条件下，微生物生长和新陈代谢才能更好进行，从而达到较好的预处理效果。

表2 微生物预处理能源草的最适因素Table 2 The optimum factors of microbial pretreatment on energy grass

2.1.1底物含水量 底物含水量对微生物生殖与生长有重要影响，甚至影响微生物的次级代谢[53]。研究表明：对大多数白腐真菌来说，底物含水量在70 %～80 %范围内，木质素降解酶活性和降解率最高[54],如虫拟蜡菌预处理含水量为75 %柳枝稷时降解率最高[29]，同一种微生物，预处理的能源草种类不同，需要的最佳含水量有所不同，例如虫拟蜡菌处理芒的最佳含水量为60 %[26]，处理柳枝稷为75 %[29]。微生物预处理能源草时，含水量过高会减少底物中固体负荷，过低则没有足够的水分满足微生物生长，均不利于木质纤维的降解[19]。

2.1.2菌种接种量 菌种接种量直接影响微生物的生长与繁殖。接种量过大，菌株在有限环境内对有限营养物质产生的竞争活动和代谢产物等因素会对微生物所分泌酶的量和酶活产生很大影响；如果接种量过小，会导致底物过剩，微生物所分泌的酶量达不到所要求预处理效果[55-56]。在预处理能源草时，要确定合适的菌种接种量。王蕾等[23]研究多孔菌预处理芦苇的效果与接种量的关系，发现接种量在10 %～60 %范围内，随着接种量的增加，芦苇纸浆中木质素先下降后升高，最佳接种量为50 %。

2.1.3预处理温度 温度主要影响菌株生长繁殖和分泌的酶的活力，在其他条件一定,温度较高时，微生物的新陈代谢加快且分泌的生物酶分子扩散快, 不一定有利于酶的合成，且酶本身的稳定性随温度升高而降低；温度较低时，微生物生长速度慢,可能有利于延长产酶时间，进而影响产酶量[57-58]，合适的温度对于微生物预处理至关重要。有研究发现，在一系列温度范围内(37～45 ℃)多孔菌(P.varius)预处理芦苇，随着预处理温度的升高，芦苇中的木质素降解率先升高后下降，最适预处理温度为41 ℃[23]。微生物新陈代谢会产生大量热量，导致培养基温度逐渐升高，不利于微生物的正常生长，影响预处理的效果。在大规模固态培养中，散热应该是反应容器设计时要考虑的主要因素之一。

2.1.4预处理时间 微生物预处理是微生物的代谢过程，一般需要几周到几个月的时间[18]，但部分微生物所需的时间较短，如黄孢原毛平革菌只需几天到几周就能达到较好的降解效果[31]。Gui等[25]用黄孢原毛平革菌处理甘草，纤维素降解率随着预处理时间增加而增加，在21 d达到最大降解率。对于部分微生物，预处理时间越长，降解效果不一定越好。王蕾等[23]用多孔菌预处理芦苇后制浆，发现随着预处理时间增加，浆料的Kappa值不断下降后略有上升；Liu等[24]研究密孔菌处理柳枝稷发现酸不溶木质素降解率随着预处理时间增加呈现先增加后降低的趋势，72 d后酸不溶木质素含量反而超过了对照组。由此可见，通过延长预处理时间可增加微生物预处理效果，特别是在处理初期，延长处理时间效果明显，然而时间过长，降解效果反而降低，这可能是由于预处理后期底物浓度降低、产物浓度升高以及反应中产生的抑制物使菌株酶活力降低甚至消失。

2.1.5微生物预处理的限制因素 能源草中的木质素含量是微生物酶水解和发酵的主要障碍之一，降解底物中的木质素，可增加生物质的孔径，使纤维素酶更容易与底物表面接触[59]。为取得较高的木质素去除率和纤维素糖化率，需要的预处理时间较长[30]。纤维素和半纤维素是转化生物质能源的主要原料，但在微生物预处理过程中，不可避免会造成部分纤维素和半纤维素的损失[18]，导致原料转化效率降低[60]。因此，木质素含量、纤维素和半纤维素的损失以及较长的预处理时间等问题均成为微生物预处理大规模应用的限制条件。

2.2微生物预处理工艺的改进

对微生物预处理方法进行改进，主要是对影响预处理的几种主要因素进行完善。一般来说，可以通过梯度试验等方法找出微生物预处理的最佳底物含水量、微生物接种量、预处理温度，但较长的预处理时间和底物损失量等限制因素往往难以解决，需要通过深入的研究来完善。

2.2.1联合预处理方法 近年来，为了解决微生物预处理时间较长的问题，部分学者提出一些比较实用的解决办法，如联合预处理(微生物预处理后再用物理或化学方法处理)能够提高能源草降解率，协同提高酶解效率，缩短预处理时间[61-63]，而且联合预处理既能取得较好的降解效果，所需时间也大大缩短，且所用的物理或者化学方法条件都比较温和，耗能和环境污染较少，是一种很有前景的方法。

微生物预处理与化学预处理方法相结合，例如微生物-稀酸法。Ma等[64]用白腐真菌紫杉木齿菌(Echinodontiumtaxodii)和褐腐真菌多孔菌处理水葫芦10 d，再用0.25 %硫酸在28～100 ℃下处理15～60 min，结果表明：与单独酸处理相比，酶解后还原糖产量增加了1.13～2.11倍，酒精产量提高1～2倍。Gui等[25]用黄孢原毛平革菌预处理甘草21 d，再用2 mol/L醋酸处理0.5～3 h，底物木质素和全纤维素降解率最高达到47.4 %和27.5 %，是单独酸处理的3.3和1.87倍。

微生物-蒸汽法是微生物与物理预处理方法的组合法，Taniguchi 等[65]利用平菇对稻草秸秆进行了预处理，然后增加了蒸汽爆破过程，结果发现组合法的预处理时间由60 d降至30 d，并显著地提高了得糖率。常娟等[66]将蒸汽爆破预处理和微生物组合法对玉米秸秆进行了预处理，发现该方法能显著提高纤维素和半纤维素的降解率。

2.2.2青贮方法 青贮是一种传统的生物质原料保存方法能够保存大部分的干物质为生物质能源转化提供原料。如果在能源草青贮过程中添加纤维素降解菌，既能降解纤维素又能尽可能保存原料，是一种值得研究的方法。有研究发现，柳枝稷青贮保存21 d，然后高温水热预处理后转化生产燃料乙醇，其葡萄糖、木糖和半乳糖产量高于未青贮的柳枝稷，而经过168 h 的同步糖化与发酵(SSF)，青贮样品乙醇质量浓度为12.1 g/L，高于未青贮柳枝稷的乙醇浓度[67]。

2.2.3工程菌技术 从自然界中分离纯化的野生菌株产纤维素酶的活力较低，酶系不完整，无法直接投入生产，因此，利用各种手段和技术对产纤维素酶菌株进行改造以提高酶产量或改变其酶学性能是解决微生物预处理限制因素的一种很好的方法，如通过理化诱变技术、原生质体融合技术、原生质体诱变技术和基因工程技术来改良微生物[68-69]。吴珊珊[70]筛选出高产纤维素酶菌株地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，对其进行内切葡聚糖酶高表达基因工程菌的构建，结果表明重组后的菌株酶活有明显的提高。

3 建议和展望

能源草微生物预处理具有作用条件温和、环境污染少与耗能低等优点，是一种很有前景的方法，但是，纤维素降解菌种类少、纤维素和半纤维素的损失和较长的预处理时间等问题限制了它的生产应用。为解决这些问题，需要加强相关基础研究，找到高效的能源草降解微生物；加大对微生物预处理方法的研究，找到解决预处理时间较长问题更有效方法。随着基因工程的发展，改进的基因工程菌将在微生物预处理过程中发挥重要的作用，同时联合预处理和复合微生物预处理等都是很有研究价值的方向。

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