反相高效液相色谱荧光检测法测定血浆或肝组织中阿霉素含量

蔡迪鸣 张爽 刘艳杰

近年来, 随着肝脏肿瘤的局部化疗方法的快速发展, 很多肝动脉介入治疗和门静脉的化疗等方式愈加普遍［1］, 阿霉素是一种较为常见的化疗药物, 临床有效的应用在各类肿瘤的治疗之中, 但是其浓度过高会产生生物毒性, 影响骨髓造血功能, 严重时导致心力衰竭、心肺功能损害等［2］。本文旨在发现一种能够较为准确测定血浆和肝组织中阿霉素浓度的方式。

1 材料与方法

1.1 材料 选择成年大鼠30只, 雌雄不拘, 体重350 g左右。主要试剂有阿霉素(Doxorubicin, DOX)标准品, 100 mg, 中国药品生物制品会监制；柔红霉素(Daunorubicin, DAM)标准品,100 mg, 中国药品生物制品会监制［3］。主要应用仪器为美国惠普公司生产的HP100型高效液相色谱仪, HPLC色谱柱,美国惠普公司荧光检测器。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 首先, 使用HPLC不锈钢色谱柱进行试验, 其中有流动的配管, 超纯水, 0.1 mol/L的磷酸, 三乙酸等,将水相和乙酸等继续充分混合, 保证HCl的pH数值调节到2.8左右, 将流速设定为1.6 ml/min并使用荧光检测激发光和吸收光的具体波长, 内标物质为：柔红霉素, 标本进样量：保证在 50 μl左右。

1.2.2 标准品准备 设置盐酸阿霉素储备液并精密称取25 mg的盐酸阿霉素, 将其与25 ml甲醇混合溶解之后配母液,在隐蔽处储存于25 ml保存瓶之中, 制定柔红霉素的贮备液,精密化取用25 ml柔红霉素, 并将其与甲醇溶解后避光储存在25 ml的保存瓶之中, 进行备用。

1.2.3 标本处理 对大鼠进行阿霉素注射, 并获取大鼠下腔部位静脉血共计3 ml, 获取大鼠的肝脏组织共计0.5 g, 并在冰箱中储存, 进行血浆标本的有效处理, 其中吸取500 μl的血浆, 将其放置在20 ml的离心管中进行离心操作, 并适当加入100 μl工作浓度的柔红霉素制成内标物质的标准溶液, 加入100 μl的0.2 M氯化钙溶液进行静置处理［4］, 并使用pH为9.0的硼醋酸与其融合之后加入氯仿等提取液, 除去上层的水相, 加入200 μl的磷酸, 并使用旋涡混匀器进行混合处理, 离心5 min之后去上层水相。将0.5 g肝组织放入1 ml的生理盐水中进行处理, 其中内标为100 μl的柔红霉素, 摇匀5 min后使用超生匀浆处理2 min。加投入8 ml氯仿等提取液,离心处理5 min后, 获得上层清液待测。

1.2.4 检测标准 将阿霉素的溶液分别制成5、10、25、250、500、1000 μg/ml等浓度的溶液, 并将上述的溶液分别与肝部组织的柔红霉素和空白血浆进行标本处理, 将阿霉素峰面积和柔红霉素峰面积的比值与具体的浓度进行比较。

2 结果

按照上述检测方法得到色谱分析图, 将阿霉素峰面积和柔红霉素峰面积的比值为纵坐标, 浓度为横坐标绘制标准曲线, 血浆线性回归方程为：ADOX/ADAM=0.0201X+0.1105, 血浆最小检测浓度为6 ng/ml, 对于其浓度变化, 在6～1000 ng/ml中变化较好。肝脏组织线性回归方程为：ADOX/ADAM=0.0198X-0.9855, 肝脏最小检测浓度为26 ng/ml, 其应用范围为26～2000 ng/ml之间, 线性关系表现较好。见图1。

图1 阿霉素与柔红霉素峰面积关系图

3 讨论

阿霉素属于蒽环类抗肿瘤药物, 在乳腺癌、胃癌、肺癌等癌症中应用较为频繁, 在化疗过程中, 阿霉素可以有效的抑制患者体内DNA和RNA的合成, 其中对于RNA的合成抑制作用更加显著, 阿霉素作用效果相对较好, 属于周期非特异性药物［5-7］。其能够快速杀灭周期中的各类肿瘤细胞,对于急性白血病, 如急性淋巴细胞白血病、粒细胞白血病等效果良好, 其同时可以与其他的抗癌药物进行搭配使用, 但是该种药物拥有较强的副作用［8,9］, 临床对其浓度进行全面有效的检测, 现阶段, 反相高效液相色谱法已经建立, 并成为了药物浓度检测的重要方法, 得到了临床的广泛使用, 当前的研究中, 对于血浆和唾液中的阿霉素研究数量一般较多,但是对于组织内部阿霉素浓度的研究内容相对较少。

本次实验中, 首先需要将阿霉素从肝组织中成功释放出来, 可以使用组织的匀浆处理诱导肝细胞的破裂, 适当释放阿霉素, 对于阿霉素来说, 氯仿等生物有机溶剂属于相对较好的提取溶剂, 能够将阿霉素从匀浆液中完成有效的提取到有机溶剂中, 使用氮气的方式进行吹干操作后, 仍然需要进行有机物的溶解操作, 检测到的药物物质将会更加集中化,检测值显著降低, 对检测的精度有着较好的提高作用, 但是以上的匀浆方式不能诱导肝细胞的破裂, 很多阿霉素无法从肝细胞中较好的释放出来, 很多药物不能直接通过萃取过程转移到有机溶剂之中, 因此, 对于肝脏的检测限度值一般高于血浆的检测限度值。

在本次的研究中, 首先进行匀浆处理, 其次沉淀蛋白质,萃取, 有机复溶等, 最终有效的测定了血浆和肝部组织中的阿霉素浓度, 为阿霉素的浓度测定和后续的药物质量研究有着较好的作用。

综上所述, 反相高效液相色谱荧光检测法能够较好地测定血浆和肝脏组织内阿霉素的药物浓度, 其操作的灵敏度相对较高, 且较为简单, 稳定性强。

［1］ 符继红, 褚金芳 , 王吉德, 等.固相萃取反相高效液相色谱荧光检测法测定拟南芥中的生长素.分析化学, 2009, 37(9):1324-1327.

［2］ 潘义勤, 潘秀萍, 潘继刚.反相高效液相色谱-荧光检测法测定粉针剂中帕米膦酸二钠含量及有关物质.中国药物应用与监测, 2008, 5(1):29-31.

［3］ 张宏文, 钱立新, 王蔚青, 等.反相高效液相色谱荧光检测法测定血浆及膀胱中阿霉素的浓度.药学与临床研究, 2006, 14(1):4-6.

［4］ 姚蓝, 徐和新 , 苗积康, 等 .反相高效液相色谱-荧光检测法测定血浆中拉贝洛尔的含量.中国药物应用与监测, 2005, 2(3):18-20.

［5］ 秦永平, 邹远高, 梁茂植, 等.柱切换-荧光检测反相高效液相色谱法测定血浆中特布他林浓度.分析化学, 2004, 32(9):1216-1218.

［6］ 傅承光, 徐宏达.反相高效液相色谱法柱后调节PH胶束增敏荧光检测四环素类药物的研究.色谱, 1995(5):365-367.

［7］ 何素梅, 魏树礼, 吴传斌, 等.反相高效液相色谱荧光检测法测定血浆或肝组织中阿霉素含量.药物分析杂志, 1994(4):8-11.

［8］ 张志友, 张文怡, 李宏伟, 等.反相高效液相色谱法检测组织中阿霉素含量的实验研究.武警后勤学院学报(医学版), 2000(1):37-40.

［9］ 吕兴萍, 童姗姗.反相高效液相色谱荧光检测法测定血浆中阿霉素的浓度.安徽科技学院学报, 2008, 22(5):31-35.