HPLC-ELSD法测定三草鼻咽清煎膏剂中黄芪甲苷的含量

朱日明 罗瑜

三草鼻咽清煎膏剂全方由黄芪、鱼腥草、 夏枯草、龙胆等十一味中药组成, 具有清热解毒、散结消炎的功效, 主要用于鼻咽部鼻咽部慢性炎症疾病。为了有效地控制制剂的内在质量, 本研究选择方中黄芪的活性成分黄芪甲苷作为质控指标［1］, 采用HPLC-ELSD法对其含量进行方法学分析研究,现将实验结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Agilent1200高效液相色谱仪(配有G1312A二元泵、蒸发光散射检测器和安捷伦色谱工作站)；色谱柱Eclipse XDB-C18柱 (200 mm×4.6 mm, 5 μm)；YP202N 型电子天平(上海精密仪器有限公司)。

黄芪甲苷对照品(购自中国食品药品检定研究院, 供含量测定用)；三草鼻咽清煎膏剂 (韶关市中医院制剂室自制 , 批号 ：20170228, 20170414, 20170605, 20170810, 规格 ：100 g/瓶)；阴性样品(按处方比例, 除去被检药材同法制备而成);乙腈(色谱纯)；水为重蒸馏水；其他试剂均为分析纯。

1.2 溶液制备 精密称取黄芪甲苷对照品适量, 加甲醇配制成约0.1 g/L的溶液, 作为对照品溶液；精密量取三草鼻咽清煎膏剂50 ml, 转移至分液漏斗中, 用水饱和的正丁醇提取4 次 (30 、30 、25 、25 ml), 合并正丁醇液 , 用氨试液洗涤 2 次 ,40 ml/次, 正丁醇液回收溶剂至干, 残渣加甲醇溶解, 并移至5 ml量瓶中, 用甲醇稀释至刻度, 摇匀, 用0.45 μm微孔滤膜滤过, 取续滤液作为供试品溶液；取按处方比例及制备工艺制备不含黄芪的阴性样品, 按照供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱：Eclipse XDB-C18柱(200 mm×4.6 mm, 5 μm)；柱温 ：25 ℃ ；流动相 ：乙腈 -水 32∶68)；流速：1.0 ml/min；ELSD参数：漂移管温度：60 ℃；载气流速：1.6 ml/min。

1.3.2 色谱系统适用性试验 按“1.3.1”项下色谱条件,将对照品溶液、供试品溶液、阴性对照液各10 μl注入高效液相色谱仪, 测定, 并记录色谱图。

2 结果

供试品溶液中黄芪甲苷能与其他成分有较好的分离度,阴性对照液无干扰峰出现。色谱图见图1～3。

图1 供试品HPLC图

图2 黄芪甲苷对照品HPLC图

图3 阴性样品HPLC图

2.1 线性关系考察 分别精密吸取上述对照品溶液1、5、10、15、20 μL, 按拟定的色谱条件, 分别注入液相色谱仪, 记录色谱图、峰面积值。以峰面积的自然对数值为纵坐标(Y), 以浓度的自然对数值为横坐标(X), 得回归方程：Y=1.7733X+1.8092(R2=0.9990), 结果表明黄芪甲苷在0.5781～11.5614 g/L范围内峰面积与浓度之间呈良好的线性关系。

2.2 精密度试验 取同一份对照品溶液, 连续进样6次,15 μl/次, 记录黄芪甲苷峰面积, 结果RSD=0.55%。

2.3 稳定性试验 取同一份供试液, 分别于0、2、4、6、8、24 h进样, 记录黄芪甲苷色谱图的峰面积的RSD为0.19%。结果表明供试品溶液在24 h内具有良好的稳定性。

2.4 重复性试验 取同一批样品(批号为20170228)按“1.2”项下的方法制备6份供试液, 分别进样测定, 以黄芪甲苷的峰面积计算RSD为0.54%, 表明本品含量测定方法重复性良好。

2.5 加样回收率试验 精密量取已知含量的批号为20170228的样品(黄芪甲苷含量为0.0362 mg/ml)30 ml, 平行取样9份, 分别在1～3号样品中精密加入黄芪甲苷对照品溶液1.8 ml, 在4～6号样品中精密加入黄芪甲苷对照品溶液2.1 ml, 在7～9号样品中精密加入黄芪甲苷对照品溶液2.6 ml,按“1.2”项下的方法制备供试液, 按上述色谱条件测定, 计算回收率, 结果平均回收率为99.37%, RSD=0.44%。表明该方法符合定量分析的要求。见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.6 样品的含量测定 取3批样品(批号分别为20170414、20170605、20170810), 按“1.2”项下的方法制备成供试品溶液, 依方法进样10 μl测定含量。见表2。

表2 样品含量测定结果

3 讨论

3.1 本文在制备三草鼻咽清煎膏剂中黄芪甲苷的供试液时,主要参考了参照2015年版《中国药典(一部)》及相关文献［2-4］, 同时进行了黄芪甲苷不同的提取实验, 而从本院制剂室实际检验条件, 考虑成本, 操作方法, 因此本实验制备供试液采用水饱和的正丁醇提取、氨试液洗涤的方法, 确保次数及每次试剂用量, 经反复验证, 黄芪甲苷提取率较高,既缩短了样品前处理的时间, 而且样液的稳定性较好。

3.2 本文在参考关于黄芪甲苷含量测定相关文献报道的基础上［5-7］, 进行了色谱系统的优化实验。考察了流动相乙腈-水的比例、色谱分离效果, 实验结果以乙腈-水(32∶68)为流动相时, 黄芪甲苷色谱峰与其他峰能达到较好的基线分离,且出峰时间合适［8-14］。

3.3 本文以方中主药黄芪中的主要活性成分黄芪甲苷为指标, 采用HPLC-ELSD法测定其含量, 通过方法学考察表明,本方法灵敏度高, 准确可靠, 可用于三草鼻咽清煎膏剂内在质量的控制。

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