1-氯-3-丁烯-2-酮与N-乙酰半胱氨酸的反应

刘柏良,张新宇

(上海大学环境与化学工程学院,上海200444)

1,3-丁二烯(l,3-butadiene,BD)是一种产量较大的石油化工产品,常温下为无色且略有芳香气味的气体,主要用于制造合成橡胶、树脂和塑料.BD在大气中广泛存在,主要来自化石燃料和生物质的不完全燃烧,如汽车尾气和香烟烟雾等[1].

BD是具有高致癌风险的大气有机污染物之一[2].根据美国国家环境保护局的数据,当BD质量浓度为0.3µg/m3时就可达到10−5致癌风险水平[3],低于同样风险水平下苯的质量浓度(1.3～4.5µg/m3)[4].BD被认为是香烟烟雾中致癌性最强的物质[5],甚至在二手烟和三手烟中也是非常有害的挥发性有机化合物之一[6].流行病学研究已经建立了人体BD暴露与淋巴-造血系统癌症发病率升高之间的因果关联[1].

BD不是直接致癌物,其致癌效应源于代谢产物.BD有两条代谢途径:一是被细胞色素P450酶代谢生成具有致突变性和致癌性的3种环氧化物——3,4-环氧-1-丁烯,3,4-环氧-1,2-丁二醇和双环氧丁烷[7];二是在H2O2和高浓度Cl−(＞50 mmol/L)存在的情况下被髓过氧化酶 (myeloperoxidase,MPO)代谢为 1-氯-2-羟基-3-丁烯 (1-chloro-2-hydroxy-butene,CHB)(见图1)[8].前一条代谢途径主要存在于肝脏、肺脏和肾脏等器官中,而后一条途径仅能存在于骨髓细胞和血液的中性粒细胞中,因为只有这些细胞中存在MPO.由于BD会引起人体造血系统癌症[1],而造血系统位于骨髓,因此后一条途径可能与BD对人体的致癌性有密切关联.

图1 BD代谢为CHB和CBO的途径以及CBO与GSH的反应Fig.1 Metabolism of BD to form CHB and CBO,and the reaction of CBO with GSH

CHB可被乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)进一步转化为1-氯-3-丁烯-2-酮(1-chloro-3-buten-2-one,CBO)(见图1)[9].CBO是一种较强的Michael受体,容易与亲核试剂发生反应,如与核苷反应产生多种加成产物[10-12],而且被证明有较强的细胞毒性和遗传毒性[13].CBO与谷胱甘肽(glutathione,GSH)迅速反应会产生3种偶联产物,包括CBO双键端和氯甲基端分别与GSH巯基反应产生的两种单偶联产物和CBO两端均与GSH反应产生的双偶联产物(见图1)[9].

预计一旦CBO在体内形成,会迅速被细胞内GSH捕获产生GSH偶联产物.这些产物随血液循环到达肾脏,在肾脏内被代谢产生CBO与N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)的偶联产物,最终随尿排出体外.因此,CBO与NAC的偶联产物可以作为CBO形成的生物标志物.然而,CBO与NAC的反应尚未见报道.因此,本工作研究了CBO与NAC在体外生理条件(pH=7.4,37◦C)下的反应并确定了产物的化学结构.

1 材料与仪器

1.1 实验材料与试剂

NAC、重水和氘代二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)购于Sigma-Aldrich公司,高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)等级甲醇、三氟乙酸(trif l uoroacetic acid,TFA)以及其他试剂购于国药集团化学试剂有限公司,CBO按照文献[9]的方法合成,纯度为80%.

1.2 仪器

Waters Alliance 2695 HPLC系统,配置Waters 2475多通道荧光检测器.色谱柱:Agilent ZORBAX 80˚A StableBond SB-C18分析柱(4.6 mm×250 mm,5µm)及Waters SunFire Prep C18制备柱(10 mm×150 mm,5µm).Bruker Instruments Avance AV500核磁共振(nuclear magnetic resonance,NNR)光谱仪(500 MHz).

1.3 高效液相色谱方法

HPLC流动相:A相为1%甲醇,B相为30%甲醇,均使用三氟乙酸(trif l uoroacetic acid,TFA)调节pH 值至2.5.分析时使用的梯度如下:1 min时由0%B相用6 min升至93%,7 min时用1 min升至100%,17 min时用1 min降至0%,停止于18 min(流速1 mL/min);制备时使用80%B相等度洗脱14 min(流速3 mL/min).

2 实验方法

2.1 NAC与CBO(摩尔比3∶1)的反应

11.4 mg(70µmol)NAC溶于4 mL pH=7.4的磷酸缓冲液(100 mmol/L KH2PO4,150 mmol/L KCl,1.5 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA))中.取2.9 mL溶液,加入2µL CBO(17µmol),立即取样检测.37◦C下孵育30 min后再次取样检测.

2.2 NAC与CBO(摩尔比1∶2)的反应

2.3 mg(14µmol)NAC溶于1.2 mL pH=7.4的磷酸缓冲液中.取715µL溶液,加入2µL CBO(17µmol),立即取样检测.37◦C下孵育30 min后再次取样检测.

2.3 NC1和NC2的制备及结构鉴定

制备两份6.5 mg(40µmol)NAC溶于1.6 mL pH=7.4的磷酸缓冲液中的溶液.分别加入1.5和9.3µL CBO(13和81µmol),37◦C下孵育30 min,HPLC分离纯化,冷冻干燥分别得到3.2和5.5 mg产物(NC1和NC2),产率分别为63%和51%.产物溶于氘代DMSO或重水进行核磁检测.

3 结果与讨论

3.1NAC与CBO的反应

HPLC分析表明,在NAC∶CBO(摩尔比)=3∶1的情况下,CBO与NAC一经混合(即0 min的样品)即发生反应,产生两种产物,以NC1和NC2表示,保留时间分别为12.3和13.2 min,但反应30 min后NC2消失,而NC1增加(见图2(a)). 在NAC∶CBO=1∶2(摩尔比)的情况下,只有NC2产生(见图2(b)),且0和30 min时的色谱图没有明显变化.这些实验结果表明:CBO与NAC的反应速度非常快;当NAC过量时,首先形成两种产物,但最终只产生NC1;而当CBO过量时则只产生NC2.根据CBO与GSH的反应类推(见图1),预计NC1是CBO与两分子NAC形成的偶联产物(即双偶联产物),而NC2则是CBO与一分子NAC的偶联产物(单偶联产物).

图2 NAC与CBO反应混合物的HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of the reaction mixtures of NAC and CBO

3.2 产物的结构鉴定

预计NC2是一种单偶联产物,光谱较为简单,故先分析其NMR图谱(见图3).图中,以2.50处的溶剂峰作为内标,为清楚显示较高场(1.5～5.0)处的信号,低场处的两个质子信号12.83(很宽的单峰,1H)和8.24(双峰,1H,J=8 Hz)未显示.首先,根据CBO与GSH的反应情况类推(见图1),CBO与NAC的反应可能相似地产生两种单偶联产物,即CBO双键端和氯甲基端分别与NAC反应的产物.如果氯甲基端反应,则产物中存在双键,其质子的信号应该出现在5～6范围内.由于NC2的氢谱中在5～8的范围内没有任何峰,说明NC2是CBO双键端与NAC发生反应的产物.

图3 NC2在氘代DMSO中的1H NMR图谱Fig.31H NMR spectrum of NC2 in DMSO-d6

由图3可见,NC2在氘代DMSO中的氢谱共有14个质子,与预计的单偶联产物相符.低场处(12.83和8.24,图3中未显示)有两个质子的信号,12.83处是一个很宽的单峰,显然只能是羧基质子;而8.24处的峰只能是氮原子上的氢,因为该化合物中没有芳香环.其他质子的信号在1.5～5.0范围内(见图3),4.52处含2个氢的单峰应该是氯甲基质子(H-1,见图4)的信号,因为其不与其他质子偶合;4.37处只含1个质子的多重峰因其化学位移较高,应该是6位的次甲基质子;1.85处含3个氢的单峰显然是甲基质子(即H-9);余下的3个亚甲基共6个质子,化学位移从2.68～2.91,由于其存在偶合且化学位移相差不大,仅靠一维氢谱确定峰的归属有一定困难,因此收集了NC2的二维1H-1H相关光谱(correlation spectroscopy,COSY)(见图5)以及二维1H-13C异核多量子相干(heteronuclear multiple quantum coherence,HMQC)图谱(见图6).COSY图谱显示8.24处的质子(NH质子)与4.37处的质子(H-6)偶合,这与上述通过一维氢谱确定的归属相符.进一步地,COSY图谱表明4.37处的H-6与2.89(四重峰,1H)和2.73(四重峰,1H)处的质子偶合,因此2.89和2.73处的峰是5位亚甲基的两个质子的信号.这样,余下的在2.80和2.70处的两组峰(每组含2个质子,均为三重峰)显然就是3位和4位的两个亚甲基的信号.HMQC图谱表明,2.80和2.70处质子对应的13C化学位移分别为39.2和25.2处.考虑到羰基吸电子能力大大强于硫原子,故2.80处的峰应该是3位亚甲基的质子信号,而2.70处的峰则是4位亚甲基信号.至此,NC2的NMR图谱被完全解析,且光谱数据与预计结构(见图4)完全吻合.

图4 两种CBO-NAC偶联产物NC1和NC2的结构Fig.4 Structures of the two CBO-NAC conjugates(NC1 and NC2)

NC1在重水中的1H NMR图谱(见图7)共显示了18个质子,与预计的双偶联产物相符.显然,4.56～4.62处含2个氢的八重峰是2个次甲基(H-6和H-11)的信号,3.56处的单峰(含2个氢)是1位亚甲基的信号,2.06处的单峰(含6个氢)是2个甲基(H-9和H-14)的信号.余下的4个亚甲基共8个质子的信号作为密集的多重峰出现在2.82～3.13范围内.NC1的COSY图谱(见图8)表明,2.83处的峰(含2个氢,三重峰)与3.01处的峰(含2个氢)偶合,但不与4.56～4.62处的质子偶合;再以NC2的数据作为参照,确定这两组峰分别是4位和3位的亚甲基的信号.对于2.88～3.13处的峰,除了3位亚甲基的信号外,尚有4个质子的信号,它们都与4.56～4.62处的质子偶合,故为5位和10位的两个亚甲基.这样,NC1的NMR图谱被完全解析,且光谱数据符合预计结构,证明NC1是CBO与NAC的双偶联产物(见图4).

需要指出的是,NC1是一种新化合物;NC2虽然不是新化合物,但仅仅只有两篇文献报道过,且文献中完全没有给出任何结构确证信息[14-15].因此,本工作首次用NMR清楚地确定了CBO与NAC的两种偶联产物的结构.

图5 NC2在氘代DMSO中的二维COSY图谱(化学位移未校正)Fig.5 2D COSY spectrum of NC2 in DMSO-d6(the chemical shifts are uncorrected)

图6 NC2在氘代DMSO中的二维HMQC图谱(化学位移未校正)Fig.6 2D HMQC spectrum of NC2 in DMSO-d6(the chemical shifts are uncorrected)

CBO与GSH反应产生两种单偶联产物(见图1)[9],因此预计CBO与NAC反应也可形成两种单偶联产物.但本实验只产生一种偶联产物,可能是因为NAC与GSH的反应性有差异的缘故.

图7 NC1在重水中的1H NMR图谱(DSS内标)Fig.71H NMR spectrum of NC1 in D2O with DSS as the internal standard

图8 NC1在重水中的COSY图谱(化学位移未校正)Fig.8 COSY spectrum of NC1 in D2O(the chemical shifts are uncorrected)

4 结束语

BD是一种几乎无处不在的空气污染物,因而研究其致癌机理具有很重要的现实意义.目前针对BD通过MPO的代谢研究还较少,但由于这条途径与BD对人体的致癌性存在可能的关联,因此特别值得深入研究.不过这条途径上的代谢产物CHB和CBO都仅仅只在体外实验中得到证实,因此需要研究CHB和CBO在暴露于BD的活体内是否能够产生.因为CBO反应性很强,不可能在活体内直接被检测到,只能通过检查CBO与生物分子如GSH、蛋白质和DNA等的反应产物而间接地推测其存在.因此,本工作识别的两种CBO-NAC偶联产物可以作为标样来检测CBO是否能够在活体内产生,为后续研究打好了基础.

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