鱼糜加工漂洗液蛋白质回收工艺研究

◎ 陈庆全，曾庆祝，李红良

（1.广州沃邦生物科技有限公司，广东 广州 510000；2.广州大学，广东 广州 510000）

鱼糜是将鱼经过去鳞、采肉、漂洗、精滤、脱水搅拌和冻结等工艺加工，再经擂溃或斩拌、成型、加热和冷却等工序制成的鱼糜制品。在鱼糜生产过程中，鱼肉必须经过2 次或2 次以上的漂洗才能去除阻碍鱼糜凝胶形成和影响鱼糜感官品质的杂质，经过漂洗可提高鱼糜的凝胶强度和白度[1]。漂洗废水中一般含有0.5%～2.5%的蛋白质，是值得回收利用的高价值蛋白资源[2-3]。

1 材料与仪器

牛血清白蛋白购自国药集团化学试剂有限公司，1%海藻酸钠溶液、1%壳聚糖溶液。

紫外分光光度计购自尤尼柯(上海)仪器有限公司。罗非鱼鱼糜加工漂洗液原液，取之于项目合作单位，带回实验室后置于冰柜中，-18 ℃冷冻备用。

2 实验方法

2.1 以海藻酸钠为单一絮凝剂条件优化

2.1.1 pH 对回收漂洗液蛋白质的影响

分别取40 mL 漂洗液加入3 mL 海藻酸钠溶液，用1 mol·L-1HCl 溶液和1 mol·L-1NaOH 溶液调节pH 为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 和6.5 静置30 min，4 000 r·min-1离心10 min[5-6]。

2.1.2 温度对回收漂洗液蛋白质的影响

分别取40 mL 漂洗液置于温度15、20、25、30、35、40、45 ℃和50 ℃下，漂洗液中分别加入3 mL 海藻酸钠溶液静置30 min，4 000 r·min-1离心10 min[7]。

2.1.3 时间对回收漂洗液蛋白质的影响

分别取40 mL 漂洗液加入3 mL 褐藻胶溶液静置10、20、30、40、50、60、70 min 和80 min，4 000 r·min-1离心10 min。

2.1.4 海藻酸钠溶液浓度对回收漂洗液蛋白质的影响

分 别 取1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL 和5.0 mL 海藻酸钠溶液加入40 mL 漂洗液中，pH 控制在4.5 左右静置30 min，4 000 r·min-1离心10 min[8-9]。

2.2 以壳聚糖为单一絮凝剂条件优化

2.2.1 pH 对回收漂洗液蛋白质的影响

分别取40 mL 漂洗液加入3 mL 壳聚糖溶液，用1.0 mol·L-1HCl 溶液和1.0 mol·L-1NaOH 溶液调节pH 为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 和8.5，静置90 min， 4 000 r·min-1离心10 min[10]。

2.2.2 温度对回收漂洗液蛋白质的影响

分别取40 mL 漂洗液置于温度15、20、25、30、35、40、45 ℃和50 ℃下，漂洗液中分别加入3 mL 壳聚糖溶液，静置90 min，4 000 r·min-1离心10 min[11]。

2.2.3 时间对回收漂洗液蛋白质的影响

分别取40 mL 漂洗液加入3 mL 壳聚糖溶液静置30、50、70、90、110、130、150 min 及170 min， 4 000 r·min-1离心10 min。

2.2.4 壳聚糖溶液浓度对回收漂洗液蛋白质的影响

分 别 取1.6、3.2、4.8、6.4、8.0、9.6、11.2 mL 和12.8 mL 壳聚糖溶液加入40 mL 漂洗液中，pH 调至7.0静置90 min，在4 000 r·min-1离心10 min[12]。

2.3 以海藻酸钠-壳聚糖为复合絮凝剂条件优化

2.3.1 pH 对回收漂洗液蛋白质的影响

分别取40 mL 漂洗液放入1.5 mL 海藻酸钠溶液和1.5 mL 壳聚糖溶液，用1.0 mol·L HCl 溶液和1.0 mol·L NaOH 溶液调节 pH 为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 静置30 min，在4 000 r·min-1离心10 min。

2.3.2 温度对回收漂洗液蛋白质的影响

分别取40mL 漂洗液置于温度15、20、25、30、35、40、45、50 ℃，再取1.5 mL 海藻酸钠溶液和1.5 mL 壳聚糖溶液分别加入后静置30 min，在4 000 r·min-1离心10 min。

2.3.3 时间对回收漂洗液蛋白质的影响

分别取40 mL 漂洗液放入1.5 mL 海藻酸钠溶液和1.5 mL 壳聚糖溶液静置10、20、30、40、50、60、70、80 min，在4 000 r·min-1离心10 min[13]。

2.3.4 复合絮凝剂浓度对回收漂洗液蛋白质的影响

取0.6、1.2、1.8、2.4、3.0、3.6、4.2、4.8 mL 复合絮凝剂加入40 mL 漂洗液中（海藻酸钠溶液与壳聚糖溶液的比例是1 ∶1），pH 调至6.5 静置30 min，在4 000 r·min-1离心10 min。

2.4 等电点沉降法与絮凝法联用条件优化

2.4.1 单一絮凝剂分段回收蛋白质

根据实验方法2.1 和2.2，先以海藻酸钠为单一絮凝剂在最佳条件（浓度为0.96 mg·mL-1，pH=4.0，时间为30 min，温度为30 ℃）下先提取一部分蛋白，离心后收集相同体积的上清液；再以壳聚糖为单一絮凝剂在最佳条件（浓度为2.13 mg·mL-1，pH=7.0，时间为90 min，温度为30 ℃）再提取一次蛋白，即为所谓的分段絮凝，离心后取上清液用双缩脲法测定蛋白质含量，相同实验条件下重复8 次实验。

2.4.2 等电点沉降法与复合絮凝剂絮凝法联用回收蛋白质

根据相关文献[5-6]和实验方法2.3，先用等电点沉降法在最佳条件下回收一部分水溶性蛋白（温度为 30 ℃，pH=5.5）离心后收集相同体积的上清液；再以复合絮凝剂絮凝法的最佳提取条件再次回收蛋白（浓度为1.03 mg·mL-1，pH=6.5，时间为30 min，温度为35 ℃），离心后取上清液用双缩脲法测定蛋白质含量，相同实验条件下重复8 次实验。

2.4.3 等电点沉降与单一絮凝剂分段絮凝联用回收蛋白质

根据相关文献[5-6]、实验方法2.1 和2.2，①用等电点沉降法在最佳条件下回收一部分水溶性蛋白（温度为30 ℃，pH=5.5）离心后收集相同体积的上清液。 ②以海藻酸钠为单一絮凝剂在最佳条件下（浓度为0.96 mg·mL-1，pH=4.0，时间为30 min，温度为30 ℃） 先提取一部分蛋白，离心后收集相同体积的上清液。③以壳聚糖为单一絮凝剂在最佳条件下（浓度为 2.13 mg·mL-1，pH=7.0，时间为90 min，温度为30 ℃）再提取一次蛋白，离心后取上清液用双缩脲法测定蛋白质含量，相同实验条件下重复8 次实验。

3 分析方法

3.1 双缩脲法测定蛋白质的含量

3.1.1 蛋白质标准曲线的测定

分别取浓度为1 mg·mL-1牛血清蛋白质标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL 和1.0 mL 于试管中，不足 1 mL 则用双蒸水补齐至1.0 mL，各试管均分别加入4.0 mL 双缩脲试剂，在漩涡震荡器上振荡混匀，室温 （20 ～25 ℃）下反应30 min。以空白管调零，在波长540 nm，比色皿杯径1.0 cm 下用紫外-可见光分光光度计测定吸光值（OD）。以蛋白质质量浓度为横坐标，以OD 为纵坐标作标准曲线。

3.1.2 双缩脲法测定蛋白质浓度

分别准确称取0.5 mL 漂洗液原液和上清液于试管中，加双蒸水至1.0 mL，再加入4.0 mL 双缩脲试剂，室温下静置30 min。以空白管调零，在波长540 nm 处测定OD，依据标准曲线求得浓度值[14]。

3.2 蛋白质回收率的计算

蛋白质回收率按公式（1）计算：

式（1）中，ρ 为蛋白质回收率，C 为上清液漂洗液蛋白质浓度（mg·mL-1），C0为原漂洗液蛋白质浓度（mg·mL-1）。

4 结果与分析

4.1 蛋白质标准曲线

蛋白质的标准曲线见图1，回归方程为y=0.048 9x+ 0.001 5，R2=0.999 5，表明蛋白质质量浓度在0 ～10 mg·mL-1范围内与吸光度线性关系良好，后续试验中检测蛋白质浓度根据此标准曲线计算。

4.2 以海藻酸钠为单一絮凝剂对蛋白质回收率的影响

4.2.1 pH 对蛋白质回收率的影响

结果如图2 所示，在pH=4.0 左右时蛋白质回收率最高，pH 超过4.0 后回收率迅速降低，海藻酸钠与蛋白质之间通过范德华力、氢键和静电相互作用，在接近蛋白质等电点时，呈电中性，这种作用最大[5]。

图1 牛血清白蛋白的标准曲线图

图2 pH 对回收鱼糜漂洗液蛋白质的影响图

4.2.2 温度对蛋白质回收率的影响

结果如图3 所示，可知温度对回收率的影响很小，曲线波动幅度不大，考虑到实际生产成本需要，取漂洗液在接近室温30 ℃的蛋白质回收率，50 ℃左右时会因为蛋白质的加热变性而导致回收率逐渐上升[4]。

图3 温度对回收鱼糜漂洗液蛋白质的影响图

4.2.3 时间对蛋白质回收率的影响

结果如图4 所示，吸附时间持续到30 min 时蛋白质回收效果最佳，这说明蛋白质与海藻酸钠的络合作用需要一定时间，若时间过长则可能出现解吸附现象。

图4 时间对回收鱼糜漂洗液蛋白质的影响图

4.2.4 海藻酸钠溶液浓度对蛋白质回收率的影响

结果如图5 所示，当海藻酸钠溶液浓度增加到0.96 mg·mL-1时，继续增加絮凝剂用量会导致蛋白回收率降低，可能是因为过高的海藻酸浓度导致漂洗液粘稠度上升，阻碍了蛋白质的絮凝。

图5 海藻酸钠溶液浓度对回收鱼糜漂洗液蛋白质的影响图

根据上述结果，综合鱼糜漂洗的实际生产及各影响因素，可以得出以海藻酸钠为单一絮凝剂回收罗非鱼鱼糜加工漂洗液中蛋白质的最佳条件：pH 为4.0，温度为30 ℃，处理时间为30 min，海藻酸钠溶液浓度为0.96 mg·mL-1，此条件下蛋白回收率可达59.58%。

4.3 以壳聚糖为单一絮凝剂对蛋白质回收率的影响

4.3.1 pH 对蛋白质回收率的影响

结果如图6 所示，随着pH 的递增，蛋白质的回收率增大，pH 为7.0 时，回收率最大，偏碱性时回收率会降低，pH 的改变影响了鱼糜漂洗液中蛋白质所带电荷的性质和数量，从而导致壳聚糖与蛋白质之间的相互作用发生变化。

4.3.2 温度对蛋白质回收率的影响

结果如图7 所示，升高温度有利于加强壳聚糖与蛋白质间的聚沉作用；当温度超过30 ℃时，壳聚糖与蛋白质间的吸附架桥作用和静电吸引达到最大，50 ℃后继续升温会使蛋白质变性聚沉而增加回收率。

图7 温度对回收鱼糜漂洗液蛋白质的影响图

4.3.3 时间对蛋白质回收率的影响

结果如图8 所示，随着时间的推移架桥作用和静电吸附能力越来越强，蛋白质回收率逐渐上升，但时间太长可能会出现脱附现象，90 min 最为合适。

4.3.4 壳聚糖溶液浓度对蛋白质回收率的影响

结果如图9 所示，当浓度增加到2.13 mg·mL-1时蛋白质回收率达到极大值，继续增加则会使回收率降低，可能是因为过量的壳聚糖阻碍了壳聚糖与蛋白质之间的有效吸附。

图8 时间对回收鱼糜漂洗液蛋白质的影响图

图9 壳聚糖浓度对回收鱼糜漂洗液蛋白质的影响图

根据上述实验结果，综合鱼糜漂洗的实际生产及各影响因素，可以得出以壳聚糖为单一絮凝剂回收鱼糜漂洗液中蛋白质的最佳条件：pH为7.0，温度为30 ℃，处理时间为90 min，壳聚糖溶液浓度为2.13 mg·mL-1，此条件下蛋白的回收率可达47.28%。

4.4 以海藻酸钠-壳聚糖为复合絮凝剂对蛋白质回收率的影响

4.4.1 pH 对蛋白质回收率的影响

结果如图10 所示，pH=6.5 附近接近蛋白质的等电点，蛋白质易絮凝沉淀，提高蛋白质回收率。在酸性条件下，壳聚糖的氨基基团与海藻酸钠的羧基基团发生静电作用形成复合物，削弱了壳聚糖与蛋白质间的聚沉作用[14]。

4.4.2 温度对蛋白质回收率的影响

结果如图11 所示，当温度低于35 ℃时，温度的升高有利于加强分子热运动，增大复合絮凝剂与蛋白间的作用强度，有利于增大蛋白质回收率；当超过50 ℃ 时，蛋白质开始变性聚沉和复合絮凝，使回收率上升。

图10 pH 对回收鱼糜漂洗液蛋白质的影响图

图11 温度对回收鱼糜漂洗液蛋白质的影响图

4.4.3 时间对蛋白质回收率的影响

结果如图12 所示，在30 min 时，蛋白质回收率最高，超过30 min后，蛋白质回收率呈逐渐减小的趋势，时间过长可能会出现脱附解离现象。

图12 时间对回收鱼糜漂洗液蛋白质的影响图

4.4.4 复合絮凝剂添加浓度对蛋白质回收率的影响

结果如图13 所示，随着壳聚糖-海藻酸钠溶液浓度的提高，蛋白质的回收率缓慢增大，当浓度增加至1.03 mg·mL-1时，蛋白质回收率达到极大值，继续增加，回收率会降低，这是因为壳聚糖-海藻酸钠絮凝剂浓度过高，增大了溶液浊度，阻止了蛋白质与壳聚糖-海藻酸钠絮凝剂的有效吸附。

图13 复合絮凝剂浓度对回收鱼糜漂洗液蛋白质的影响图

根据上述实验结果，综合鱼糜漂洗的实际生产及各影响因素，可以得出以壳聚糖-海藻酸钠溶液为絮凝剂回收鱼糜漂洗液中蛋白质的最佳条件：pH 为6.5，温度为35 ℃，处理时间为30 min，复合絮凝剂浓度为1.03 mg·mL-1，在此条件下测得蛋白的回收率可达43.13%。

4.5 等电点沉降法与絮凝法联用对蛋白质回收率的影响

采用以海藻酸钠和壳聚糖为单一絮凝剂分段沉降、等电点沉降法与以海藻酸钠-壳聚糖为复合絮凝剂絮凝法联用、等电点沉降与分别以海藻酸钠和壳聚糖为单一絮凝剂分段沉降絮凝联用3 种工艺对鱼糜漂洗液蛋白质回收率结果如图14 所示。

图14 表明，以单一海藻酸钠絮凝剂进行第一步沉降絮凝，海藻酸钠与漂洗液中的部分蛋白先通过氢键作用聚沉；第二步用单一壳聚糖絮凝剂沉降絮凝的分段絮凝，壳聚糖与漂洗液中余下的水溶性蛋白通过静电作用聚沉，双重作用下可得到蛋白回收率均值为64.65%；第一步使用等电点沉降法，利用蛋白质等电点处溶解度变差聚沉一部分蛋白，第二步使用以海藻酸钠-壳聚糖为复合絮凝剂絮凝进行聚沉，蛋白回收率均值为57.17%；第一步使用等电点沉降法，以单一海藻酸钠絮凝剂进行第二步沉降絮凝，第三步用单一壳聚糖絮凝剂沉降絮凝，蛋白回收率均值为65.34%。

图14 3 种工艺回收的蛋白质回收率比较图

5 结论

等电点沉降法和海藻酸钠-壳聚糖复合絮凝剂絮凝沉降联用比海藻酸钠-壳聚糖复合絮凝剂絮沉法蛋白质回收率高，可能是因为等电点沉降法最为靠近鱼糜漂洗液中蛋白的等电点，从而回收絮凝作用无法回收的蛋白。絮凝法中，分段絮凝比复配絮凝的蛋白质回收率高，可能是因为壳聚糖的氨基基团与海藻酸钠的羧基基团相互发生静电作用形成复合物，削弱了各自与蛋白质的聚沉作用，而以单一絮凝的形式各自分段絮凝则可避免两种絮凝剂反应。回收方法的联用比单一回收方法的蛋白回收率高，可能是因为等电点调节法，以海藻酸钠为单一絮凝剂，以壳聚糖为单一絮凝剂和以海藻酸钠-壳聚糖为复合絮凝剂沉降回收的蛋白分别对应漂洗液中不同分子量的蛋白，所以当各种方法联用时可提高蛋白质回收率。

根据上述实验结果，和Batista I[15]等研究的等电点沉降法对鱼糜漂洗液蛋白质进行回收的5种工艺中，回收率最高的是等电点沉降与分别以海藻酸钠和壳聚糖为单一絮凝剂分段沉降絮凝联用，蛋白回收率均值为65.34%；以海藻酸钠和壳聚糖为单一絮凝剂分段沉降次之，回收率均值为64.65%；以单一海藻酸钠絮凝剂絮凝的蛋白回收率为59.58%为第三高；等电点沉降法与以海藻酸钠-壳聚糖为复合絮凝剂絮凝法联用的蛋白回收率均值为57.17%；最后是以单一壳聚糖絮凝剂絮凝回收漂洗液蛋白，回收率均值为47.28%。