清咽口服液水提醇沉工艺研究

　　　　　　　　　

红河卫生职业学院，云南　蒙自　661199

清咽口服液处方来源于临床使用的经验方射干豆根桔梗汤，主要由射干、山豆根、桔梗、甘草等组成，临床用于预防和治疗上呼吸道感染及流感，疗效较好。处方中君药为射干，文献资料[1-2]表明，含射干的复方制剂多具有清利咽喉功能，常被用来预防或治疗上呼吸道感染感染及流感。由于汤剂服用量大，不方便携带，在使用上有一定的局限性，因此特将射干豆根桔梗汤开发成院内制剂清咽口服液。根据药材成分、药理作用、中药用药习惯和临床疗效，为最大限度提取和保留该经验处方的活性成分，实验采用水提醇沉工艺制备清咽口服液。在前期工艺研究中，对影响水提工艺的影响因素(浸泡时间、提取次数、提取时间、加水量)和醇沉的影响因素(药液浓度、醇沉时间、醇沉浓度、醇沉温度)进行单因素考察，在此前提下进行正交设计，考察各影响因素的交互作用，实验以处方中君药射干的主要活性成分次野鸢尾黄素的转移率和总皂苷转移率作为评价指标，对清咽口服液的制备工艺进行优化，为下一步申报医院制剂提供依据。

1　仪器与材料

1.1仪器 Waters e2695-2489高效液相色谱仪(美国Waters公司)，AUW220型电子天平(日本岛津)，C18色谱柱(Agilent ZORBAX SB-C18, 4.6 mm×250 mm, 5 μm, 美国安捷伦公司)，FA1004型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)。

1.2材料射干(批号：20110403)、山豆根(批号：20110206)、桔梗(批号：20110711)、蝉蜕(批号：20110523)、甘草(批号：20120605)等均购置云南白药天紫红饮片厂。次野鸢尾黄素对照品(批号：111557-200610，中国药品生物制品检定所)，甲醇为色谱纯，水为纯净水，其余所用试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1水提工艺研究

2.1.1正交试验优选通过前期单因素考察结果，在清咽口服液的提取过程中，影响提取效果的主要因素有浸泡时间(因素A)、加水量(因素B)、提取次数(因素C)、提取时间(因素D)，每个因素各选3个水平，各因素水平见表1。每次取处方量药材100 g，按表2安排正交试验，并定容至100 mL进行含量测定，选择次野鸢尾黄素转移率和总皂苷转移率进行综合评价，其中次野鸢尾黄素转移率权重系数0.7，总皂苷转移率权重系数0.3。

表1　水提因素水平表

2.1.2次野鸢尾黄素含量测定

2.1.2.1色谱条件及系统适用性[3]以十八烷基反向键合硅胶为填充剂，C18色谱柱(AgilentXDB-C18，4.6 mm×150 mm，5 μm)；甲醇-0.2%磷酸(50∶50)为流动相；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长：266 nm。理论板数按次野鸢尾黄素峰计算应不低于8000。

2.1.2.2测定方法取处方量药材100 g，采用上述水提工艺进行提取，药液浓缩，定容至100 mL，从中精密量取25 mL药液于分液漏斗中，加乙酸乙酯萃取4次，每次25 mL，摇匀，合并乙酸乙酯萃取液，用25 mL 2%的盐酸溶液洗涤1次，回收乙酸乙酯萃取液，甲醇定容至25 mL，以微孔滤膜(0.45 μm)过滤，取续滤液作为供试品溶液。另精密称取次野鸢尾黄素对照品2.1 mg，加甲醇溶解并定容至10 mL得浓度为0.21 mg/mL的对照品溶液。精密吸取上述供试品溶液各10 μL注入液相色谱仪，按“2.1.2.1”项下色谱条件进行测定。计算结果见表2～4。

表2　水提正交实验设计及结果

注：射干药材中次野鸢尾黄素含量为0.13%。次野鸢尾黄素最高转移率+总皂苷最高含量=100，次野鸢尾黄素转移率=水提药液中次野鸢尾黄素苷的量/药材中次野鸢尾黄素的量×100%，次野鸢尾黄素转移率评分=次野鸢尾黄素转移率/次野鸢尾黄素最高转移率×70%；总皂苷提取率评分=水提总皂苷提取率/总皂苷最高含量×30%；综合评分=次野鸢尾黄素转移率评分+总皂苷含量评分[4]。

表3　水提正交工艺直观分析结果

表4　水提正交工艺方差分析结果

注：F0.05(2,2)=19

2.1.3总皂苷提取率测定[5]精密量取供试品溶液25 mL，用等倍量的乙醚(25 mL)萃取2次，弃去乙醚萃取液，下层药液再用水饱和正丁醇萃取3次，每次25 mL，回收正丁醇萃取液后，105 ℃烘干至恒重。总皂苷供试品测定：采用重量分析法，分析天平精密称量其重量。

2.1.4射干药材中次野鸢尾黄素的含量测定精密称取射干粉末(过四号筛)0.1202 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.5结果分析从表2～5可知，各因素影响顺序为：C>B>D>A，经方差分析，提取时间、提取次数、加水量对提取均有显著影响。并经水提验证实验验证，结果稳定、可靠。即最佳水提工艺为：A1B3C3D3。

2.1.6水提工艺验证按清咽口服液处方称取药材1000 g，选择最佳水提工艺进行提取，即加10倍量水，浸泡0.5 h，提取3次，每次2 h，滤过，合并滤液，减压浓缩，蒸馏水定容至1 L。结果见表5。

表5　水提工艺验证试验表

2.2醇沉工艺优选[6-7]

2.2.1正交试验设计为最大限度除去杂质，保留有效成分，减少患者的服用量，在浓缩的水提液中加适量的乙醇除去树胶、淀粉、蛋白等杂质。通过前期单因素考察结果，选择醇沉温度(A)、药液浓度(B)、乙醇浓度(C)、静置时间(D)四个主要影响因素进行考察，每个因素各选择3个水平，各因素水平见表6。按清咽口服液上述优选最佳水提工艺进行提取、浓缩，表7安排醇沉正交试验，静置后的药液过滤，醇沉药液减压回收至无乙醇味，蒸馏水定容。评价指标次野鸢尾黄素含量测定、总皂苷的测定见“2.1.2.1、2.1.3”，醇沉供试品测定方法见2.2.2，结果见表7～9。

2.2.2醇沉供试品制备方法取处方量药材1000 g，加10倍量水，浸泡0.5 h，提取3次，每次2 h，滤过，合并滤液，减压浓缩，蒸馏水定容至1 L。按照表7醇沉工艺正交设计进行实验，回收乙醇至无醇味，蒸馏水定容至100 mL，从中精密量取25 mL药液，置分液漏斗中，加乙酸乙酯萃取4次，每次25 mL，摇匀，合并乙酸乙酯萃取液，用2%的盐酸溶液25 mL洗涤1次，回收乙酸乙酯，甲醇定容至25 mL，以微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液。按“2.1.2.1”项下色谱条件进行测定。计算结果见表6～8。

表6　醇沉因素表

表7　醇沉正交试验及结果

注：次野鸢尾黄素最高转移率+总皂苷最高转移率=100分(次野鸢尾黄素转移率=醇沉药液中次野鸢尾黄素苷的量/水提最佳工艺中次野鸢尾黄素的量×100%)，次野鸢尾黄素转移率评分=次野鸢尾黄素转移率/次野鸢尾黄素最高转移率×70%；总皂苷提取率评分=醇沉总皂苷提取率/水提最佳工艺中总皂苷含量×30%；综合评分=次野鸢尾黄素转移率评分+总皂苷含量评分。

表8　醇沉正交试验直观分析

表9　醇沉正交试验方差分析

2.2.2结果分析 从表7～9可知，各影响因素顺序为：C>B>D>A，方差分析结果表明，B因素对醇沉结果有显著性影响，A因素、C因素和D因素对结果无显著影响，故最佳醇沉工艺为A2B1C3D1。

2.3验证试验按清咽口服液处方称取药材，最佳水提工艺进行提取，即浸泡0.5 h，加10倍量水，提取3次，每次2 h，滤过，合并滤液，减压浓缩，再按最佳醇沉工艺：药液浓度1.0 g/mL，乙醇浓度为70%，15 ℃静置12 h。结果见表10。

表10　醇沉精制工艺验证试验表

3　讨论

咽炎属于上呼吸道感染范畴，多为病毒感染，而现代医学主要使用抗生素进行治疗，资料[8-9]表明，抗菌素既不能改变本病的病程和转归，也不能因此而有效地预防普通感冒的细菌性并发症。随着中医药现代化进程的推进，在传统中药基础上研发的中药新药具有临床疗效好、起效时间快、服用方便、不良反应少、价格优廉等优势，同时体现了中医辨证论治、同病异治的特色，发挥了中医药的特色优势。同时，由于中药复方成分非常复杂，同一药材在不同复方中可能作用不同。研究在工艺设计时根据组方的功能主治，针对每味中药在组方中君臣佐使的地位，查阅文献分析其所含的有效成分、药理作用，充分考虑其合理性，再根据提取原理和预实验的结果，选择适宜的准备工艺路线。

清咽口服液处方中射干为君药，含有次野鸢尾黄素，具有抗病毒、抗菌、消炎的作用[10]。通过控制君药中的次野鸢尾黄素转移率来考察制备工艺的可行性。此外，结合总皂苷转移率(有效部位)进行综合评价，其原因在于中药复方制剂是多方位、多靶点共同作用的药物，通过射干中次野鸢尾黄素和有效部位总皂苷进行综合评价，使制剂的药效和质量得到保证。同时，增加对有效部位的控制，对企业的质量检查、质量控制，降低经济成本。

在水提工艺和醇沉过程中，首先对影响提取、纯化的各个因素进行了单因素考察，确定各个因素的水平范围，再采用正交设计实验对各个因素的交互作用进行考察，筛选出清咽口服液的最佳水提工艺为10倍量水，浸泡0.5 h，提取3次，每次2 h；最佳醇沉工艺为药液浓度1.0 g/mL，乙醇浓度为70%，15 ℃静置12 h。

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