毛果杨CBF/DREB1基因家族生物信息学分析

丁 咚，陈亚娟，崔进荣，魏建华，张玉红，张杰伟*

(1.东北林业大学, 森林植物生态学教育部重点实验室, 黑龙江 哈尔滨 150040；2.北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心, 农业基因资源与生物技术北京市重点实验室，北京 100097)

【研究意义】C重复序列结合因子/干旱应答元件结合蛋白(c-repeat binding factor/dehydration-responsive element binding protein 1, CBF/DREB1)是植物特有的一类转录因子，属于AP2/EREBP(apetla2/ehylene responsive element binding protein)类转录因子亚家族。迄今已发现的CBF/DREB1 转录因子基因内均无内含子，且含有一段由约60个氨基酸构成的AP2/ERF DNA结合结构域(AP2结构域)，除此之外，在AP2结构域之前含有保守的核定位信号区(nuclear localization signal, NLS)：PKK/RPAGRxKFxETRHP(PKKPAGR)序列，之后含有DSAWR序列，这两段氨基酸序列已经成为区分其他AP2/EREBP转录因子的特征序列[1-2]。 植物中CBF/DREB1类转录因子都能通过AP2 结构域特异性的与CRT/DRE (c-repeat/dehydration-responsive element)顺式作用元件(A/GCCGAC)结合，激活响应低温、干旱和高盐等非生物胁迫应答基因，从而提高植物的抗逆性[3-4]。【前人研究进展】 1997年，Stockinger 等利用酵母单杂交方法首次从拟南芥cDNA文库中分离到DRE /CRT结合蛋白并命名为AtCBF1[5]。随后，Gilmour等从低温处理后的拟南芥cDNA 文库中鉴定出与AtCBF1在同一染色体上顺序排列的两个DRE /CRT 结合蛋白AtCBF2/DREB1C 和AtCBF3/DREB1A[6]。后续的研究发现，AtCBF4/DREB1D受干旱和ABA 诱导且不受低温胁迫诱导[7]，AtCBF5/DDF2/DREB1E和AtCBF6/DDF1/DREB1F均能够响应高盐胁迫诱导[8-9]。目前，已经从玉米[10]、胡杨[11]、海岛棉[12]等多种植物中分离鉴定出CBF 转录因子。由美国能源部启动并实施的杨树全基因组测序计划的完成[13]，为后续通过生物信息学挖掘、鉴定和分析杨树功能基因提供重要的基础。【本研究切入点】本研究从毛果杨基因组数据库出发，重点分析毛果杨CBF基因家族进化关系、编码蛋白的保守结构域和磷酸化位点等，为进一步研究杨树CBF 蛋白的生物学功能以及其磷酸化修饰提供重要信息。

1 材料与方法

1.1 杨树CBF/DREB1基因家族基因组、cDNA和蛋白序列的获得

拟南芥(Arabidopsisthaliana)CBF/DREB1基因及其推导的蛋白序列来自TAIR数据库(http://www.arabidopsis.org)；毛果杨(Populustrichocarpa)CBF/DREB1基因及其推导的蛋白序列下载自phytozome 数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Ptrichocarpa)；胡杨(P.euphratica)CBF/DREB1基因及其推导的蛋白序列下载自胡杨基因组数据(http://me.lzu.edu.cn/stpd/#main_tabs=0)；海岛棉CBF蛋白序列来自NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

分别以拟南芥AtCBF1(AT4G25490)、AtCBF2 (AT4G25470)、AtCBF3(AT4G25480)、AtCBF4 (AT5G51990)、AtCBF5(AT1G63030)和AtCBF6 (AT1G12610)蛋白序列为参比序列，利用phytozome 数据库(杨树)中Blast 程序进行BlastP检索，检索结果的全序列E值大于e-8的舍去，再利用美国国家生物技术信息中心提供的在线CDS(conserved domain search)程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)预测这些蛋白有无AP2结构域，同时利用欧洲生物信息研究所在线Clustal Omega程序进行多重序列比对，寻找AP2结构域前后是否含有PKKPAGR和DSAWR序列，同时具有这两个特征的蛋白序列属于CBF/DREB1基因家族。

1.2 植物CBF/DREB1基因家族编码蛋白系统进化树的构建及保守基序分析

利用Clustal X(2.0)[14]软件对鉴定出所有毛果杨CBF蛋白、6个拟南芥CBF蛋白、8个胡杨CBF蛋白[15]和5个海岛棉CBF蛋白[12]进行多重序列比对，使用MEGA 6.0[16]软件，采用邻接(neighbor-joining，NJ)算法构建系统进化树，进行1000 次Bootstrap 抽样。应用在线软件MEME(http://meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi)对拟南芥和毛果杨的CBF蛋白保守基序进行分析[17]。参数设置如下：基序的最大发现数目是2 个，其它参数为程序默认值。

1.3 杨树CBF/DREB1基因家族编码蛋白磷酸化位点预测

利用NetPhos 3.1 Server在线软件[18](http://www.cbs.dtu.dk)对鉴定出所有毛果杨CBF蛋白序列进行磷酸化位点预测，所有参数都选用程序默认值。

2 结果与分析

2.1 杨树CBF/DREB1基因家族的鉴定和命名

分别以6个拟南芥CBF蛋白序列为参比序列，利用phytozome 数据库提供的Blast P程序进行检索，共得到11个毛果杨候选CBF基因。利用保守基序在线预测软件MEME进行验证AP2保守结构域的存在，同时在其前后分别含有PKKPAGR和DSAWR序列，初步确定了6个毛果杨CBF基因。毛果杨CBF基因分布在第1、4、9、12和15五条染色体上，根据通用植物基因的命名方法，对鉴定到的6个CBF基因进行了命名，并统计了这6个基因对应的转录本、别名、染色体定位、基因长度以及对应的推导蛋白长度和内含子个数等，推导出这6个基因的蛋白质长度从219个氨基酸到225个氨基酸不等(表1)。

表1 毛果杨CBF/DREB1基因家族的基本特征

图1 拟南芥和毛果杨的CBF/DREB1家族基因编码蛋白保守基序分布Fig.1 Distribution of conserved motifs in Arabidopsis and P. trichocarpa CBF/DREB1 proteins

2.2 杨树CBF/DREB1基因家族保守结构域分析

利用在线软件MEME对6个AtCBF蛋白序列和6个PtCBF蛋白序列保守基序进行分析，结果表明拟南芥和毛果杨CBF基因家族蛋白序列中均包含由基序1(相似度为5.0e-454)和基序2(相似度为8.2e-259)共同构成的AP2保守结构域(图1)。

2.3 杨树CBF/DREB1基因家族蛋白相似性和系统进化分析

利用进化树分析软件MEGA 6.0 对6个拟南芥AtCBF蛋白、5个海岛棉GbCBF蛋白、8个胡杨PeuCBF蛋白和6个毛果杨PtCBF蛋白全蛋白序列进行进化分析。结果显示：这26个CBF按照同源进化关系可以分为3个亚家族，分别含有13、4和8个成员(图2)。第Ⅰ亚家族由拟南芥、海岛棉、胡杨和毛果杨共同组成；第Ⅱ亚家族由胡杨和毛果杨组成，第Ⅲ亚家族中不含有拟南芥成员。毛果杨CBF/DREB1基因家族分布于3个不同的亚家族中，其中毛果杨PtCBF5和PtCBF6、胡杨PeuCBF1和PeuCBF5、拟南芥AtCBF1～6、海岛棉GbCBF1～3聚类于第Ⅰ亚家族；毛果杨PtCBF3和PtCBF4、胡杨PeuCBF4和PeuCBF8聚类

于第Ⅱ亚家族；毛果杨PtCBF1、PtCBF2、胡杨PeuCBF2、PeuCBF3、PeuCBF6、PeuCBF7、海岛棉GbCBF4和GbCBF5聚类于第Ⅲ亚家族。利用欧洲生物信息研究所在线Clustal Omega程序对6个毛果杨的蛋白序列进行多重序列比对，发现他们的氨基酸相似性在46.45 %～81.31 %，其中PtCBF3 和PtCBF4氨基酸序列的相似性达到 81.31 %(表2)。

图2 拟南芥、海岛棉、胡杨和毛果杨的CBF/DREB1蛋白进化树Fig.2 Phylogenetic tree for Arabidopsis,Gossypium barbadense,P. euphratica and P. trichocarpa CBF/DREB1 proteins

PI-PLC家族PtCBF2PtCBF3PtCBF4PtCBF5PtCBF6PtCBF165.950.548.559.6458.11PtCBF251.7649.7557.2758.41PtCBF381.3149.346.45PtCBF448.1147.62PtCBF579.27

表3毛果杨基因组中CBF/DREB1蛋白潜在磷酸化位点分析

Table 3 Analysis of the CBF/DREB1 proteins potential phosphorylation site inP.trichocarpa

CBF家族丝氨酸Serine苏氨酸Threoine酪氨酸TyrosinePtCBF12141PtCBF21451PtCBF31070PtCBF41573PtCBF51561PtCBF61971

2.4 杨树CBF/DREB1基因家族蛋白磷酸化位点预测

利用在线软件NetPhos 3.1 Serverl对6个毛果杨CBF/DREB1蛋白进行磷酸化位点预测，结果显示PtCBF1～6蛋白中存在着17～27个丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸潜在磷酸化位点，预测磷酸化位点主要是以丝氨酸的形式存在，其次是苏氨酸，络氨酸的磷酸化位点最少(表3)。预测PtCBF1潜在磷酸化位点中存在21个丝氨酸、4个苏氨酸和1个酪氨酸位点。PtCBF3潜在蛋白磷酸化位点中不含有酪氨酸(图3)。

3 讨 论

本研究鉴定毛果杨CBF/DREB1基因家族含有6个成员，而已鉴定的拟南芥[18]、水稻[18]、海岛棉[12]和胡杨[15]CBF/DREB1基因家族分别含有6、10、5和8个成员，这说明在植物进化过程中，CBF/DREB1基因可能经历了不断发生谱系的特异扩张和拷贝丢失。毛果杨CBF/DREB1基因家族的6个成员均只含有1个外显子，均含有AP2结构域，且在AP2结构域的前后分别含有PKKPAGR和DSAWR序列，这表明CBF/DREB1基因家族的高度保守性，推测这些转录因子在植物诸多生理过程中起着类似作用。不同植物中CBF/DREB1基因家族含有的成员数目存在差异，推测不同植物的各成员在特定组织响应低温、干旱和高盐等信号后精细调节各生理过程。

进化分析表明，毛果杨CBF/DREB1基因家族分布于不同的亚家族中，PtCBF5、PtCBF6、PeuCBF1、PeuCBF5、AtCBF1～6和GbCBF1～3聚类于第Ⅰ亚家族；PtCBF3、PtCBF4、PeuCBF4和PeuCBF8聚类于第Ⅱ亚家族；PtCBF1、PtCBF2、PeuCBF2、PeuCBF3、PeuCBF6、PeuCBF7、GbCBF4和GbCBF5聚类于第Ⅲ亚家族。目前，CBF/DREB1基因家族各成员确切的功能分析主要集中在拟南芥中。近年，伴随着植物基因组学、生物信息学等新兴学科的兴起，大量的CBF基因从不同植物中克隆出来，部分林木CBF/DREB1基因成功克隆并功能也得到初步分析。第Ⅲ亚家族中毛果杨PtCBF1、PtCBF2和胡杨PeuCBF2、PeuCBF3、PeuCBF6 和PeuCBF7 与并不是一一对应关系，表明经过长期进化选，毛果杨和胡杨CBF/DREB1基因也发生了分离，这与贾会霞[15]等的研究结果一致。胡杨PeuCBF1～3和PeuCBF5～7均在雄花序和雌花序的表达量较高，且胡杨PeuCBF1～3和PeuCBF5～6主要响应低温胁迫。据此推测： 毛果杨PtCBF1和PtCBF2可能也主要在雄花序和雌花序中表达且响应低温胁迫。最近的研究发现，胡杨PeuCBF4过量表达转化三倍体毛白杨，获得的转基因毛白杨的光和效率较对照(野生型和转空载体转基因毛白杨)增加34.7 %～165.7 %、瞬间水利用效率增加48.9 %～103.7 % 、叶绿素荧光fv/fm增加2.14 %～5.89 % ；同时SOD活性增加、MDA含量降低；转基因毛白杨表现出PeuCBF4、PtRCI2A 和PtDI21表达量显著上调同时伴随有植株矮化现象。表明：胡杨PeuCBF4过量表达能够显著增强转基因植株的抗逆性[11]。鉴于毛果杨PtCBF4与PeuCBF4同源性最高，据此推测毛果杨PtCBF4在植物抗逆生理中发挥重要作用。聚类在一起的不同植物的同源基因可能具有不同的生物学功能[19]，因此不能简单推测毛果杨CBF/DREB1基因家族各成员的生物学功能，其各成员确切的生物学功能还需要逐一进行功能验证。

图3 毛果杨CBF/DREB1蛋白磷酸化位点预测Fig.3 Phosphorylation site prediction of CBF/DREB1 proteins in P. trichocarpa

磷酸化分析表明，毛果杨PtCBFs蛋白存在大量潜在磷酸化位点。目前，植物CBF/DREB1 转录因子确切的磷酸化作用尚未见报道。研究发现御谷PgDREB2A 是一个磷酸化蛋白，其体外磷酸化位点是苏氨酸残基。御谷PgDREB2A蛋白磷酸化后不能与RD29A启动子上DRE 元件(ACCGAC)结合，在磷酸酶作用下，PgDREB2A 结合DRE 元件的能力得到了恢复，表明：御谷PgDREB2A蛋白磷酸化作用负调控其对DNA 的结合活性[20]。毛果杨PtCBFs蛋白中潜在的磷酸化位点还需要通过定点突变、体外磷酸化等试验进一步研究和验证。

4 结 论

毛果杨基因组中鉴定出6个CBF/DREB1基因家族成员，均不含有内含子，位于毛果杨的第1、4、9、12和15染色体上。毛果杨CBF/DREB1蛋白均含有AP2结构域及其前后的特征序列：PKKPAGR和DSAWR均含有大量潜在的磷酸化位点。

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