贵州施秉云台山土壤有机磷细菌的解磷能力及生长状况

胡 娟，罗世琼，杨占南*，赵 铖，韦小芳，霍鸿浩，张曲玲

(1. 贵州师范大学 贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室，贵州 贵阳 550001；2. 贵州师范大学 生命科学学院， 贵州 贵阳 550001)

【研究意义】贵州施秉云台山是舞阳河国家级风景名胜区的重要组成部分，为典型的喀斯特地形地貌，具有独特的自然景观和丰富的植被生态系统[1-2]，人为干扰少。以白云岩、石灰岩、泥灰岩等碳酸盐类长期风化的石灰缺磷土壤为主[3-4]。由于磷是限制植物生长最重要的营养元素之一，在云台山石灰石缺磷土壤生长的丰富植物已形成了植物吸收有效磷素的适应机制。研究该适应机制对云台山生态环境的保护具有重要意义。【前人研究进展】云台山生态环境生长条件下，植物获得磷的来源主要通过吸收矿物质中无机磷素以及动植物残体分解的磷素[5-8]，由于土壤存在大量解磷微生物，能够将植物不能吸收的磷转化为植物可以直接吸收的形态[9-10]。然而，对于有机难溶磷素转化为植物可吸收的有效磷素的机理尚不清楚。【本研究切入点】尽管有关土壤有机磷细菌的解磷能力研究已有大量的文献报道[11-13]，然而，对施秉云台山独特的土壤有机磷细菌的解磷能力及其生长状况的相关研究鲜见报道。因此，研究施秉云台山土壤有机磷细菌的解磷能力及其生长状况，对了解其植物磷的吸收机制以及生态系统的维护具有重要意义。【拟解决的关键问题】以施秉云台山喀斯特土壤的有机磷细菌为研究对象，分析有机磷细菌的溶磷指数、磷酸酶活性、生长状况及碳源的利用率，以探明贵州施秉云台山土壤有机磷细菌的解磷机制，为云台山喀斯特自然保护区生态环境的保护及可持续发展提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 取样 有机磷细菌分离于贵州施秉云台山喀斯特土壤，从山脚到山顶垂直高度每间隔100 m采集土壤样品，采集土壤深度为0～20 cm，共10样地，每个样地又采集3个样点，分别置于透明无菌塑料袋，带回实验室，过2 mm筛，剔除石子和植物根系，混合。贮藏于4 ℃冰箱，用于有机磷细菌分离、纯化。

1.1.2 培养基制备 基础培养基：NaH2PO4·H2O 0.5 g，(NH4)2SO42.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，蒸馏水 1000 mL。

固体养基：葡萄糖 10 g，酵母浸粉 0.5 g，琼脂 20 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，CaCl20.1 g，去离子水1000 mL，卵磷脂(现配现用)。

液体培养基：参照蒙金娜培养基[12]进行改进，酵母粉0.5 g，琼脂20 g，葡萄糖10 g，(NH4)2SO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.002 g，NaCl 0.3 g，CaCO35 g，MnSO4·7H2O 0.002 g，去离子水 1000 mL，pH 7.0～7.2，卵磷脂。

固体和液体培养基加入卵磷脂前，需121 ℃灭菌30 min。

卵磷脂制备：用75 %酒精消毒棉球擦洗干净鸡蛋外壳，去掉蛋清，将2个蛋黄置于已灭菌的 100 mL 烧杯中，加水(无菌)40 mL混合均匀即成卵磷脂，1000 mL培养基加入蛋黄液60 mL。

1.1.3 分离纯化 在超净工作台中称取土壤样品10 g，加入250 mL已装有无菌去离子水90 mL和少许玻璃珠的三角瓶中，封口后置于25 ℃恒温摇床以 141 r/min震荡30 min。采用10倍稀释法形成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的土壤稀释液，分别取0.1 mL涂布在基础培养基上，每个浓度3次重复。涂布完毕，静置15 min 后，封口，倒置于生化培养箱(25 ℃)，暗光培养3～5 d，待透明斑出现，即有机磷细菌。再接种到纯化培养基中，不断分离、纯化得出有机磷细菌，选取其中4株进行下一步试验。

1.2 解磷能力分析方法

采用溶磷指数评价得到的有机磷细菌对卵磷脂的解磷能力。将分离纯化得到的菌株用液体培养基培养3 d后，点接种法接种到纯化固体培养基中，5次重复，封口，倒置平板置于生化培养箱25 ℃，暗光培养5 d后，测定其菌落的菌圈和溶磷圈大小。计算溶磷指数,

溶磷指数 = (溶磷圈-菌圈)/菌圈。

1.3 磷酸酶活性测定

液体培养基培养3 d后，分别将分离纯化得到的悬浮液1 mL置于10 mL离心管中，然后加入甲苯0.2 mL和磷酸缓冲液(pH 6.5)3 mL，再加用磷酸缓冲液配制的对硝基苯磷酸二钠溶液(0.05 mol/L)1 mL，摇匀加盖，37 ℃培养箱培养1 h，然后加入1 mL CaCl2(0.5 mol/L)及3 mL NaOH (0.5 mol/L)，摇匀，2500 r/min离心5 min，取上清夜于10 mL离心管4000 r/min再离心5 min，取上清液410 nm比色，用752型紫外分光光度计测定吸收光值。以每mL有机磷细菌悬浮液每小时消耗对硝基苯磷酸二钠的μmoL数表示磷酸酶活性。

1.4 有机磷细菌的生长状况

取液体培养基置于50 mL三角瓶(25 mL/瓶)中，3 次重复。灭菌后，每瓶分别接入分离纯化得到的悬浮液2 mL，并设置对照，28 ℃培养，用752型紫外分光光度计测定0、1.5、3.5、6、8、12、16、18和20 h 时液体培养液的OD。根据OD值的变化反映有机磷细菌的生长状况。

1.5 碳源的利用率测定

用基础培养基分别制成含1 %葡萄糖和蔗糖作为碳源的2种培养液，以 50 mL/瓶置于100 mL三角瓶中，灭菌后，每瓶分别接入分离纯化得到的悬浮液2 mL，对每种培养液设置1个对照，3次重复。28 ℃培养6 h用752型紫外分光光度计测定培养液的透光率，计算其相对碳源的利用率。

1.6 数据统计

数据通过Excel进行整理和绘图，采用SPSS 18.0统计软件进行方差分析、单因素方差分析(ANOVA)检验样地间酚类物质、土壤特征是否存在差异显著；采用LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 土壤中分离纯化的菌株

经不断分离、纯化得到40株有机磷细菌，选取其中4株编号分别为OPBS12、OPBS13、OPSB14和 OPBSB32进行下一步试验(图1)。

a=OPBS12, b=OPBS13, c=OPSB1, d=OPBSB32图1 土壤中分离的有机磷细菌Fig.1 Isolated organophosphate bacteria from soil

菌株Strain溶磷圈(cm)Dissolvingphosphorusring菌圈(cm)Bacteriacircle溶磷指数DissolvedphosphorusindexOPSB131.53b1.10a1.39cOPSB121.43b0.93a1.54cOPSB321.50b0.78b1.94bOPSB142.20a0.78b2.84a

注：同列不同小写字母表示各菌株对的溶磷圈、菌圈及溶磷指数差异显著 (P<0.05)。

Note: Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05) between the dissolved phosphate circle, the bacterial circle and the dissolved phosphorus index of the same strain.

2.2 有机磷细菌的解磷能力

由表1显示，OPBS12、OPBS13、OPSB14和OPBSB32的4株有机磷细菌的溶磷指数为1.39～2.84，溶磷指数最高值为最低值的1.47倍，其中OPSB14与OPBS12、OPBS13和OPBSB32的溶磷指数存在显著性差异，表明其溶磷能力存在显著性差异；OPBSB32与OPBS12和OPBS13溶磷指数存在显著性差异，表明其溶磷能力存在显著性差异。各菌株溶磷指数可知，OPSB14的溶磷能力最强，4株有机磷细菌的溶磷能力为OPSB14﹥OPBSB32﹥OPBS12﹥OPBS13。

2.3 有机磷细菌的磷酸酶活性

菌株来源于贵州施秉云台山森林表层土壤为弱酸性，故分析液体培基中各菌株分泌胞外酶(磷酸酶)活性。由图2可见，各菌株的磷酸酶活性为35.79～83.28 mmol/(mL·h)，且最高值比最低值高出48.49 mmol/(mL·h)。OPBS12、OPBS13、OPSB14和OPBSB32的磷酸酶活性间均呈显著差异，其磷酸酶活性大小为OPSB14[83.28 mmol/(mL·h)]﹥OPBSB32[64.57 mmol/(mL·h)]﹥OPBS12[47.67 mmol/(mL·h)]﹥OPBS13[35.79 mmol/(mL·h)]，与溶磷能力的结果相一致。说明，OPSB14、OPBSB32、OPBS12和OPBS13降解有机磷素的能力存在显著性差异，表明不同磷酸酶活化土壤能力存在差异。

2.4 有机磷细菌的生长状况

由图3显示，OPBS12、OPBS13、OPSB14和OPBSB32培养液不同有机磷细菌培养液的OD值随培养时间的增加而增加，其OD值的变化趋势为OPSB13>OPSB12>OPSB32>OPSB14。除OPBS14和OPSB32培养液在 0～8 h时的OD值变化差异不显著外，OPBS12、OPBS13、OPSB14和OPBSB32培养液的OD值随生长时间的变化均呈显著差异性。说明OPBS12、OPBS13、OPSB14和OPBSB32菌株在培养液中的生长速度存在差异，部分差异显著；其生长速度为OPSB14﹥OPBSB32﹥OPBS12﹥OPBS13，其OPSB14的生长速度最快，OPBS13的生长速度最慢，与解磷能力及磷酸酶活性的试验结果基本一致。然而，OPSB14的解磷能力最强，磷酸酶活性最高，生长繁殖速度最快，暗示具有较强的活化土壤有机磷素的能力，具有作为微生物肥料的开发应用价值。

小写字母表示不同菌株磷酸酶活性差异显著 (P < 0.05)The lowercase letters indicate that the phosphatase activity of the different strains is significantly different (P < 0.05)图2 有机磷细菌分泌的磷酸酶活性Fig.2 The activity of organic phosphorus bacteria secrete phosphatase

图3 不同培养时间各有机磷细菌培养液的OD值Fig.3 The OD value of organophosphorus bacteria culture solution at different culture time

2.5 有机磷细菌对碳源的利用率

由图4显示，不同有机磷细菌对葡萄糖和蔗糖碳源的相对利用率。OPBS12、OPBS13、OPSB14和OPBSB32对葡萄糖碳源的相对利用率存在显著性差异，相对利用率为OPBS13>OPBS32>OPBS12>OPBS14，最高碳源的相对利用率(OPBS13)是最低碳源的相对利用率 (OPBS14)的3.61倍；而OPBS13对蔗糖碳源的相对利用率与OPBS12、OPSB14和OPBSB32对蔗糖碳源的相对利用率呈差异性显著，而OPBS12、OPSB14和OPBSB32对蔗糖碳源的相对利用率之间差异性未显著，相对利用率为OPBS14>OPBS32>OPBS12>OPBS13；OPBS13和OPBS32对葡萄糖碳源的相对利用率大于对蔗糖碳源的相对利用率，OPBS14和OPBS12则相反。而对溶磷能力强的OPBS14，适量利用蔗糖作为碳源，有利于其生长发育。OPBS13对葡萄糖的利用最佳，OPBS12和OPSB14对蔗糖的利用最佳，而OPBS32对葡萄糖和蔗糖的利用均佳。表明，有机磷细菌的生长受不同碳源的影响，不同的有机磷细菌适应于不同的碳源转化，这为有机磷细菌大规模的扩繁和利用提供重要的应用价值。

3 讨 论

磷元素是植物繁衍生息所必须的大量元素之一，也是植物的重要组成部分，并在植物代谢及生长发育过程中发挥重要作用[15-16]。研究表明，土壤中存在无数微生物，将难溶解态磷转变为植物能吸收的有效态，将这些微生物统称为解磷微生物。其中能将动植物残体有机态磷分解为无机态磷的细菌即有机磷细菌。从施秉云台山喀斯特土壤分离、纯化的4株有机磷细菌，OPSB14 的溶磷能力最强，生长曲线显示其生长速度也最快，具有可作为微生物肥料的开发利用价值。

不同大小写字母表示同一菌株对不同碳源和不同菌株对同一碳源的相对利用率存在显著差异性(P<0.05)Different capital letters indicate that there is a notable difference in the relative utilization of different carbon atoms in the same strain (P<0.05); Different lowercase letters indicate that there is a notable difference in the relative utilization of the same carbon in different strains (P<0.05) 图4 有机磷细菌对碳源的相对利用率Fig.4 Relative utilization rate of organic phosphorus bacteria to carbon source

有机物中的磷元素转化主要依赖于有机磷细菌，该细菌通过向周围环境分泌胞外磷酸酶，将有机态磷通过酶解转化为无机态磷，从而提高磷素的吸收效率。其中，磷酸酶主要参与土壤有机磷素的降解，使有机物中的结合磷转化为植物有效吸收的磷组分，从而提高土壤中磷元素对植物的有效性。因此，有机磷细菌的解磷能力与磷酸酶的活性密切相关。有机磷细菌培养液的光密度(OD)较准确反映其培养液的有机磷细菌浓度或生长速度变化，因此，利用分光光度计，通过分析有机磷细菌培养液的OD值评价有机磷细菌浓度高低或生长速度快慢，即透光率大说明有机磷细菌浓度低或生长速度慢，反之亦然。通过比较，4株菌的磷酸酶活性为OPSB14>OPBSB32>OPBS12>OPBS13，与溶磷能力的结果相一致。但其解磷能力还受营养、碳源、pH等因素的影响。该研究中，各有机磷细菌对碳源的利用也存在差异，解磷优势菌株OPSB14对蔗糖的相对利用率高，因此，可以通过改变培养条件，最好地发挥有机磷细菌的解磷优势从而应用于生产。

4 结 论

通过对从贵州云台山森森林土壤筛选的4 株有机磷细菌的溶磷指数、磷酸酶活性、生长状况、碳源利用率分析，初步明确，不同有机磷细菌的解磷能力存在差异，其解磷能力与有机磷细菌分泌胞外磷酸酶活性有关，并且受不同碳源利用的影响，为进一步研究贵州云台山土壤有机磷降解以及植物对土壤磷素吸收机制提供科学依据。

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