车前草干、鲜品提取物有效成分含量的对比研究＊

李剑琦 ，刘宇政 ，余承欢 ，曾飞 ，冷红文 ，杨慧 ，郭新秀

(1、江西省医学科学院，南昌 330006；2、南昌大学第四附属医院，南昌 330003)

车前草为车前科植物车前 （Plantago asiatica L）或平车前（Plantago degresa Willd）干燥全草，车前草主要含有熊果酸、齐墩果酸、桃叶珊瑚苷、黄酮类化学成分，具有祛痰、止咳、利尿等作用，临床上常用于治疗水肿，淋病，肺热咳嗽[1]，清下焦湿热[2]等症。在我国古今医学典著中均有药物鲜品治疗疾病的记载，如三鲜汤、四生丸等[3]，车前草亦常以鲜品应用于中医临床，随着保鲜技术的发展，使得对中药鲜品的研究呈上升趋势，而中药鲜品和干品其有效成分和药理作用往往会有所不同[4]，因此对于车前草鲜品有必要进行更深入的研究。熊果酸作为车前草的一个主要成分，具有护肝、抗肿瘤，可明显改善肝纤维化大鼠的肝功能[5]；总黄酮作为已被认可的具有生物活性的物质。本文通过以车前草中主要成分熊果酸和总黄酮为指标，探讨车前草鲜品干品的成分差别，为进一步拓展车前草鲜品的利用，提高车前草制剂的质量提供参考。

1　材料与方法

1.1仪器和试药DIONEX UltiMate 3000型高效液相色谱仪 （美国赛默飞科技公司）：DAD二极管阵列检测器；UV5800紫外分光光度计 （上海元析仪器有限公）；KQ-500E型超声波清洗器 （昆山市超声仪器公司）；RE-52AA型旋转蒸发仪 （上海亚荣生化仪器厂）；芦丁对照品（批号：20161111，纯度98.0%，北京坛墨质检科技有限公司）；熊果酸对照品（批号：20160705，纯度98.1%，北京坛墨质检科技有限公司）；乙腈（色谱纯，美国Fishier试剂公司）；其他试剂均为分析纯，液相用水为纯化水。车前草药材采集于赣州，鲜品到干品的质量比为5.02。

1.2提取物的制备[6，7]

1.2.1鲜品提取物的制备称取洗净晾干水分的新鲜车前草2kg，粉碎，第一次加4800ml的60%乙醇超声提取1h，过滤，药渣再加入3200ml的60%乙醇超声提取1h，过滤，合并两次提取液，旋转蒸发至干，放入60℃烘箱烘干，粉碎，即得。

1.2.2干品提取物的制备称取洗净晾干水分的新鲜车前草2kg，置于60℃烘箱中至干燥，粉碎药材，取药材粉末，提取方法同1.2.1。

1.3熊果酸含量的测定与结果

1.3.1色谱条件Kromasil C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；流动相：甲醇：乙腈：0.2%磷酸水（40：50：10）；流速：1ml·min-1； 柱温：25℃； 检测波长：210nm；进样量：20μl。 在此色谱条件下，对照品及样品的色谱图如下：

图1　车前草鲜品提取物（A）、车前草干品提取物（B）和熊果酸对照品（C）溶液的HPLC色谱图

1.3.2对照品溶液的制备精密称取熊果酸对照品溶液10.89mg，至10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，至10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得每1ml含108.9μg的熊果酸对照品溶液。

1.3.3供试品溶液的制备精密称取车前草鲜药和干药提取物浸膏粉末各0.2g，置50ml量瓶中，加80%甲醇超声使溶解，用80%甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液即得。

1.3.4线性关系考察分别精密量取对照品贮备液0.2、0.4、0.8、1.6、2.0ml，置 10ml量瓶中，加入 80%甲醇稀释至刻度，即得浓度为1.995、3.991、7.981、15.96、19.95μg·ml-1的熊果酸对照品溶液， 按“1.3.1”项色谱条件进行测定，以对照品浓度为横坐标（C），峰面积为纵坐标（A），进行回归分析，制定标准曲线，得回归方程为：A=0.1703C+0.0456(r=0.9999)，表明熊果酸在 1.995-19.95μg·ml-1浓度范围内线性关系良好。

1.3.5精密度试验取15.963μg·ml-1熊果酸对照品溶液，按“1.3.1”项色谱条件连续进样6次，测定峰面积。计算的平均峰面积的RSD=0.95%，表明本条件精密度良好。

1.3.6重复性试验取同一批车前草鲜药提取物，平行制备6份供试品溶液，按“1.3.1”项色谱条件进行进样分析，测定峰面积，计算熊果酸的平均含量为 2.980mg·g-1，RSD=1.40%，表明该方法的重复性良好。

1.3.7稳定性试验取车前草鲜药提取物，制备供试品溶液，分别在 0、2、4、6、8、24h 时精密量取20μl注入液相色谱仪，计算峰面积的RSD=1.6%，表明该样品溶液在24h内稳定性良好。

1.3.8加样回收率试验精密称取已知含量的车前草鲜药提取物约0.1g，共6份，按1：1加入熊果酸对照品，按“1.3.3”项下方法制备供试品溶液并测定，计算回收率。熊果酸的平均加样回收率为99.09%，RSD为1.0%。结果表明，熊果酸回收率符合要求，测定方法可行。结果见表1。

表1　熊果酸加样回收率试验结果

1.3.9样品的测定取车前草鲜药及干药提取物各0.2g，精密称定，制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 20μl，按““1.3.1”项色谱条件测定，采用标准曲线法计算样品中熊果酸的含量。结果：车前草鲜品提取物的含量为2.980mg·g-1；车前草干品提取物的含量为 1.479mg·g-1。

1.4总黄酮的含量测定与结果[8]

1.4.1芦丁对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品12.51mg，置100ml量瓶中，加60%乙醇溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.1201mg·ml-1对照品溶液。

1.4.2供试品溶液的制备称取车前草鲜品或者干品提取物0.1g，精密称定，置100ml量瓶中，加60%乙醇超声15min使溶解，放冷，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

1.4.3供试品溶液的测定精密量取供试品溶液2ml，置10ml量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.3ml摇匀，静置6min；再加10%硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，静置6min，再加入4%氢氧化钠溶液4ml，用60%乙醇稀释定容刻度，摇匀，静置12min，以60%乙醇溶液作空白，于510nm处测吸光度，计算浸膏中总黄酮的含量。

1.4.4标准曲线的制备精密量取对照品液0、0.5、1、2、3、4、5ml分别置于 10ml容量瓶中， 分别加入5%亚硝酸钠溶液0.3ml摇匀，静置6min；再加10%硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，静置6min，再加入4%氢氧化钠溶液4ml，用70%乙醇稀释定容至10ml刻度线，摇匀，静置12min，以60%乙醇溶液作空白，于510nm处测吸光度。以吸光度（A）为纵坐标，对照品浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为 A=0.0121C+0.0094(r=9998)，芦丁在 6.01-60.05 μg·ml-1与吸光度线性关系良好。

1.4.5精密度试验取对照品溶液3ml，置于10ml容量瓶中，照“1.4.4”项下方法，自“加入5%亚硝酸钠溶液0.3ml”起，依法测定吸光度，同份显色样品；连续测定6次，计算RSD=0.12%，结果显示精密度良好。

1.4.6重复性试验取车前草鲜品提取物0.1g，共称取6份，照“1.4.2”项下方法制备供试品溶液，精密量取2ml置10ml量瓶中，照“1.4.3”项下方法，测定吸光度，结果6份样品中总黄酮含量的RSD为1.58%，说明样品的重复性良好。

1.4.7稳定性试验取重复性项下的供试品溶液，在室温下分别放置0、30、60、120分钟，测定吸光度，计算各吸光度的相对标准偏差RSD=0.91%，说明样品的稳定性良好。

1.4.8加样回收率试验精密称取已知含量的车前草鲜药提取物约50mg，共6份按1：1加入芦丁对照品，按“1.4.2”项下方法制备供试品溶液，照“1.4.3”项下方法进行测定，计算回收率。芦丁的平均加样回收率为99.26%，RSD为1.4%。结果表明，芦丁的回收率符合要求。测定方法可行。结果见表2。

1.4.9样品的测定取车前草鲜品和干品提取物0.1g，精密称定，照“1.4.2”项下方法制备供试品溶液，照“1.4.3”项下方法进行测定，结果：车前草鲜品提取物的含量为167.8mg·g；车前草干品提取物的含量为 128.1mg·g。

2　讨论

本研究中车前草干品为鲜品经烘箱60℃干燥而来，干燥之前的鲜品与鲜品提取物所用鲜品为同一批采购，保证了原材料的一致性，从而保证最后结果的可靠性。对鲜品-干品-干品提取物，干品提取物的得膏率为5.667%；从鲜品-鲜品提取物，鲜品提取物的得膏率为5.769%，表明鲜品提取物和干品提取物的得膏率基本一致。

表2　芦丁加样回收率试验结果

在对车前草提取物中熊果酸的含量进行测定时，用纯甲醇处理提取物，提取物不易溶散，从而使熊果酸提取不完全，经过多次试验，采用80%甲醇作为提取溶剂效果较好，故采用80%甲醇处理提取物。

从实验结果看，采用相同的提取工艺，车前草鲜品提取物中熊果酸和总黄酮的含量均高于干品提取物，鲜品提取物中熊果酸含量比干品高了1倍多，鲜品提取物中总黄酮含量比干品高约30%。随着对车前草鲜品研究的深入，以及保鲜技术的发展，可以发掘出车前草鲜品的更多新用途，本实验为合理高效的利用车前草鲜品提供了一定的参考依据。

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