成年小鼠睾丸支持细胞体外快速分离与培养＊

胡旭燕，伍琼芳，张学宏

(1、江西省妇幼保健院辅助生殖中心，南昌 330006；2、江西省南昌县人民医院外二科，南昌 330299)

睾丸支持细胞又称sertoli细胞。它为生精细胞的支撑作用，并为其供给必须的营养物质，是血睾屏障的重要部分，阻挡血循环中大分子物质进入曲精管同时通过表达特异受体和其中的特定物质结合并分泌靶蛋白调节生精。许多疾病是在成年后才出现，目前现有的多是未成年小鼠睾丸支持细胞的制备，对于成年小鼠睾丸支持细胞的分离与培养的研究并不多。如何获得纯度和活率高的成年小鼠睾丸支持细胞进行培养，不仅对其基础研究有重要价值，而且在精子发生、成熟及再生等研究方向有重要意义。本研究旨在用一种快速高效的方法来获得成年小鼠睾丸支持细胞并对其进行后续培养。Setoli细胞有表达FasL的特点，采用细胞免疫化学方法对消化后所得细胞进行鉴定，以期为成年小鼠Setoli细胞后续研究和应用奠基。

1　材料与方法

1.1动物与材料雄性KM小鼠(级别：清洁级，南昌大学医学院动物实验中心，6-8周龄)4-6只。Ⅳ胶原酶、胰蛋白酶、透明质酸酶、DMEM/F12培养基、胎牛血清(北京全式金生物技术有限公司)。

1.2睾丸支持细胞分离与培养方法小鼠颈椎脱臼法处死，将其浸入体积分数为75%的酒精中静置2 min以达到表面消毒目的，再置于超净工作台上。用手术剪剪开其下腹部皮肤，找到下腹部附睾处，继续探寻精索位置并用眼科剪将其剪断，分别摘出两侧睾丸，PBS液4℃预冷半小时后加入小培养皿中，并将所得睾丸浸入其中。修剪附着的精索并剥除睾丸白膜，移入另一空培养皿内，把睾丸实质继续用眼科剪剪成约直径1mm碎块，每个睾丸加入37℃预温的酶混合液（1ml 0.1%胶原酶IV、1.5ml 0.25%(质量分数)胰蛋白酶、1ml 2mg/ml透明质酸酶），将培养皿置入37℃孵化箱，消化时间7-8min，可见皿内混合液呈粘液状及漂浮其中的片段状曲细精管。加入体积分数20%FBS 2ml终止消化，转入50ml离心管中，1000r/min离心3min，小心弃去上层清液，加入1×PBS重悬，1000r/min离心3min，再次弃去上层清后加入1×PBS重悬，200目网筛过滤，滤液1000r/min离心3min，用含20%FBS DMEM/F12培养液重悬沉淀，用移液枪轻柔多次吹打使细胞悬液充分混合均匀。取1滴细胞悬液，台盼蓝染液 （质量分数0.4%）染色后计数活细胞数。用含20%FBS DMEM/F12培养液，调整细胞浓度至4-5×105个/ml。用移液枪取5ml细胞悬浊液转入100ml培养瓶中，置于37℃、5%(体积分数)CO2培养箱中，培养6h后将培养液置换，此时可去除大部分的精原细胞，再继续培养28h，弃培养液，1×PBS液轻柔冲洗2次，加入少量 20mmol/ml Tris-Hcl(pH7.4)，低渗状态5min，弃低渗液，加入含20%FBS DMEM/F12 培养液 5ml，5%CO2，37℃培养箱中培养。

1.3睾丸支持细胞鉴定采用免疫组化法鉴定睾丸支持细胞的FasL蛋白表达情况，若其表达显示阳性者则为睾丸支持细胞，同时用Hoechst33342对细胞核进行标记以显示所获得细胞的总数。睾丸支持细胞纯度=用FasL标记显阳性细胞的数量/总细胞数。免疫组化方法如下：细胞培养2d，用新鲜配制的95%酒精固定10min；1×PBS漂洗3次×5min；固定后细胞加入山羊血清以封闭，常温孵育20min，1×PBS漂洗1次，加入兔抗鼠FasL多克隆抗体一抗混合工作液 (1∶100)，37℃孵育 3h，1×PBS漂洗3次×5min；加入带有FITC标记的山羊抗兔IgG二抗混合工作液 (1∶100)，37℃温箱内孵育30 min，1×PBS 漂洗 3 次×5min；加入 Hoechst33342（1：100） 工作液 37℃孵育 30min，1×PBS 漂洗 3 次×5 min；荧光显微镜下随机选择10个视野，不同激发光下分别观察，支持细胞显示FasL阳性 （图1）、Hoechst33342阳性为细胞总数（图2），分别计算每视野中FasL+细胞和细胞总数。睾丸支持细胞纯度＝FasL+细胞数/Hoechst33342+细胞总数×100%。

2　结果

2.1细胞存活率和产率在经过培养24、48、72h，细胞存活率都在90%以上（活细胞计数方式：台盼蓝染色），3d后睾丸支持细胞纯度在85%以上。本法每个睾丸可获得3.0×106个睾丸支持细胞。

2.2倒置相差显微镜观察睾丸支持细胞刚接种时呈圆形，体积较小，折光性强。3-4h之后细胞开始逐渐贴壁，未贴壁细胞的折光性很强，贴壁细胞则多呈圆形或椭圆形，6h后大多数都已贴壁，未贴壁的多数为精原细胞，此时进行换液，能除去大多数的精原细胞。培养24h后睾丸支持细胞胞体逐渐伸展开并且形态不规则，两侧大多可见突起，细胞核在高倍镜下观察显现为圆形或者为椭圆形，位于细胞中间或稍偏，此时仍残留有部分精原细胞，用20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.0)对细胞进行3-5min的低渗处理，去除残存的精原细胞。48h后细胞基本铺开，形成单层状，镜下观察细胞折光度较前减弱，胞质中可见较多的小空泡或微粒样物质，相邻细胞间出现交错连接。3-4d后，相邻细胞间可观察到紧密连接出现，细胞片状融合在一起，形成单层似膜状(图3)。

2.3睾丸支持细胞鉴定FasL表达免疫细胞化学染色后，睾丸支持细胞在光镜下观察可见其胞质及其胞膜颜色呈棕黄 （图4），FasL表达显示为阳性。结果表明，本方法所得细胞绝大部分高表达FasL。

图1　FASL+

图2　HOECHST 33342+

图3　睾丸支持细胞培养后第3d倒置显微镜下的细胞形态(×100)

图4　光镜下

3　讨论

本研究采用的是用一步消化法以缩短分离所需时间，并且利用体细胞的贴壁速度与生殖细胞贴壁速度的不同这个时间差，采取差速贴壁的方法分离出支持细胞。本法将其分离和纯化步骤简化，将可能存在的其他体细胞和不同阶段生精细胞的污染最大程度的减少。

睾丸支持细胞又称Sertoli细胞，其形态结构早在1865年就被德国人Sertoli完整的描述了出来，并用他的名字为其命名。不同种属的睾丸中支持细胞与生精细胞的比率不同，使得各个种属睾丸支持细胞的工作负担不同，而与每一个支持细胞发生联系的长形精子细胞的数量也大不相同。大鼠长形精子细胞与支持细胞的比值为10，非人类灵长类为6，人类为4。生精细胞密度较低和支持细胞工作负担较低使灵长类性腺每日产生的精子数量较低，故而支持细胞的功能与精子的数量密切相关。多年来的研究证明支持细胞不仅是生精细胞的载体，为其供给所需营养，而且还能合成与分泌多种物质如抑制素、雄激素结合蛋白以及一些为精子提供流动可能的液体等，参与丘脑下部-垂体-睾丸轴的神经内分泌调节，为生精细胞提供高浓度的雄激素环境并维持睾丸局部免疫豁免的功能等[1-3]。支持细胞在睾丸曲细精管中发挥维持血睾屏障功能正常的作用，不仅能够阻止外来抗原进人睾丸，启动免疫应答外，还可以保护生精细胞不受机体对自身抗原的免疫应答反应的攻击。精母细胞的表面形态与结构在无数次的增殖与分化的过程中不断发生变化，因而具有了机体自身抗原的性质[4-8]。精子形成过程中会有一些胞质残余，这些胞质会和发育中退化的生精细胞一起脱落下来，此时支持细胞就能发挥吞噬、消化的作用。FasL属于肿瘤坏死因子家族，Fas则属于其受体家族，是存在于哺乳类动物细胞表层的蛋白质分子。FasL和Fas有两种存在形式，分别为膜分子形式和可溶性分子形式。睾丸组织主要组成细胞有三种，包括生殖细胞，支持细胞及间质细胞，三者中唯一能高度表达FasL并且表达稳定的只有支持细胞一种，而且必须是是有功能的[9-14]。因此，只要FasL表达阳性即可认定为是支持细胞。以往的研究在组织消化时间大多需要15-20min，本研究将这一步时间缩短至7-8min，所获得的细胞经免疫组化的方法检测，结果发现在分离培养72h后，有85%的细胞FasL均阳性，这表明本研究所获得的细胞为睾丸支持细胞并且其纯度较高。本研究将酶混合液 （1ml0.1%胶原酶IV、1.5ml0.25%(质量分数)胰蛋白酶、1ml 2mg/ml透明质酸酶）对组织进行一步消化，减少时间，简化操作，避免了二次消化洗涤造成的细胞损失，为后续实验奠定更好的基础。

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