基于PCR检测棉花4种病原菌在新疆北部分布

萨吉达木·艾则孜，赵志强，阿孜古丽·阿不力孜，马依努尔·米吉提，郭庆元

(新疆农业大学农学院，乌鲁木齐　830052)

0　引 言

【研究意义】棉花(GossypiumhirsutumL.)是世界范围内主要的经济作物。我国棉花总产量居世界前列。新疆又是我国最大的棉花生产基地，棉花产量一直稳居全国首位[1]。但是，由于新疆棉花种植面积大，植棉区相对固定，棉花长期连作，棉花立枯病、黄萎病等土传根茎部病害发生越来越重，常常造成一些棉区的严重减产，甚至绝收，严重影响了棉花的产量和品质。根据多年调查，新疆棉区主要根茎部病害种类有立枯病、红腐病、枯萎病、黄萎病等，是田间缺苗减产的主要因素[2-3]。因此，研究分析新疆棉花主要病原菌的分布，对各地有针对性地控制这类病害及确保棉花优质高产有着极其重要的意义。【前人研究进展】1918年Atkinson[4]首次报道了在美国亚拉巴马州发现棉花枯萎病，其病原为尖孢镰刀菌萎蔫专化型(病原：Fusariumoxysporumf. p. vasinfectum (AtK) Snyd et Hans)。2006年Abd-Elsalam等[5]设计了一对438 bp的检测棉花枯萎病菌的特异性引物Fov1-Eg-f/ Fov1-Eg-r，2008年陈文霞[6]用这对尖孢镰刀菌棉花专化型的特异性引物对棉花枯萎病菌基因 DNA 进行检测，并表明该对引物特异性较强、检出率较高。大丽轮枝菌(VerticilliumdahliaeKleb．)和黑白轮枝菌(VerticilliumalbatrumReinke & Berthold)均可侵染棉花根部，引起棉花黄萎病[7]。20世纪中国学者在全国范围内的调查发现，主要棉区的棉花黄萎病菌以大丽轮枝菌为主[8]。1998年朱有勇等[9]根据大丽轮枝菌核糖体基因区段(rDNA ITS)的碱基编码序列，设计324 bp特异性引物P1/P2对该菌进行扩增，能特异性地检测棉花植株中的大丽轮枝菌；2016年庞莉等[10]，采用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR) 检测技术对已报道大丽轮枝菌的检测引物进行验证、筛选和改进，获得1对改进的特异性PCR引物VDS-F/VDS-R。立枯病(病原：RhizoctoniasolaniKohn)，又称烂根、黑根病，是棉花苗期的主要病害病[11]。2012年郑培娥等[12]利用立枯丝核菌的另一对特异性引物RSF/RSR检测出了大豆根腐病的病原中的立枯丝核菌，但灵敏度较低，仅1 ng/μL；刘萍花等[13]用立枯丝核菌的特异性引物RSF/RSR检测出了苜蓿根腐病的病原立枯丝核菌；2012年姜腾飞[14]使用设计的立枯丝核菌特异引物RsW1/RsW2检出了棉花植株内的立枯丝核菌。棉花红腐病(病原：FusariummoniliformeSheld)。2015年王晓英等[15]利用串珠镰刀菌种特异性引物Fu5/Fu4(Ⅰ型ITS2特异性)和Fu3/Fu2(Ⅱ型ITS2特异性)，建立了串珠镰刀菌PCR及复合PCR检测方法。【本研究切入点】目前，针对棉花枯萎病和黄萎病的分子检测研究较多，而关于棉花立枯病和棉花红腐病的特异性引物PCR检测、通过特异性引物PCR检测方法确定棉花主要病原菌分布情况的研究鲜有报道。研究利用已报道的棉花4种主要病原菌的特异性引物经特异性验证和灵敏度测定后，对所采集的以村(连)为单位的病株混合样品进行特异性引物PCR检测。【拟解决的关键问题】研究引物验证及体系的优化建立适于棉花病株样品中目标病原菌检测的分子检测体系，通过对各地棉花病株样品的分子检测分析，了解棉花主要根茎部病害的病原种类及各自所致病害在新疆北部的分布。

1　材料与方法

1.1　材 料

1.1.1采样

调查时间为2016年5月初至7月下旬及2017年5月初至7月下旬，调查及采样范围为新疆北部各棉花主栽区，包括塔城地区乌苏市、奎屯市附近团场、沙湾县及附近团场；博州地区博乐市、精河县及附近团场、石河子市及附近团场；昌吉州的昌吉市、玛纳斯县、呼图壁县附近团场，合计5市、4县、17团场，共有9个市县级(含附近团场)的采样区域。

1.1.2供试病株样品

棉花子叶期至蕾铃期，从北疆各地，按每个市、县(团)3个村(连)，每村(连)3个棉田进行调查，每田选择5个采样点，每采样点随机选择30穴采集病样，并按每田1份病株样品(15个病株以上)进行采样。在室内将病株样品干燥后，接每村(连)3块田，每田选取5个病株，合计15株，经冲洗，风干后剪取根部感病部位(约50 mm长)，剪碎(约1 mm大小)，混匀，制成以村(连)为单位的病株混合病样，-20℃保存备用。

1.1.3供试菌株

立枯丝核菌(菌株号：RBHS15-112、RAKP15-211)、尖孢镰刀菌(菌株号：FKBC15-112、FKZAKT15-212)、串珠镰刀菌(菌株号：FBYL15-111、FKYPH15-111)、大丽轮枝菌(菌株号： VB811-41、V991-33)、各菌2菌株。均为前期研究工作中，从新疆棉花病样中分离纯化并经致病力测定后确定的主要病原菌，由新疆农业大学农学院植物病理实验室分离、鉴定并提供，用作分子检测过程中阳性对照。链格孢霉(菌株号：An11-23、An11-45)、茄腐镰刀菌(菌株号：FS12-93)、黑曲霉(菌株号：Aa15-8)、匍枝根霉(菌株号：RN12-95)，各菌2菌株。为病原菌分离中常出现的非致病菌，由新疆农业大学农学院植物病理实验室分离、鉴定并提供，用于引物特异性检测。

1.1.4供试培养基及供试引物

供试培养基为PSA斜面培养基和平板培养基，用于各菌株的保存和扩繁。

供试引物为通过文献收集，并经引物特异验证后优选的4种病原菌的4对特异性引物，分别为：大丽轮枝菌特异性引物VDS-F/VDS-R[10]、尖孢镰刀菌棉花专化型特异性引物Fov1-Eg-f/ Fov1-Eg-r[5]、立枯丝核菌特异性引物RSF/RSR[13]和串珠镰刀菌特异性引物FUS1/FUS2[16]。 4种引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成、提供。表1

表1经验证后的4种主要病原菌的特异性检测引物
Table1Specific primer for detection of 4 main pathogens

引物名称Primer引物序列(5′-3′)DNAsequenceofprimer检测对象Detectionobject片段大小Fragmentsize(BP)退火温度Tm(℃)来源SourceRSFGCACACTCTTCTCTTTCATCCA立枯丝核菌RSRTTAGAAGCGGTTCGTCTGCAR．solaniFov1-Eg-fCCACTGTGAGTACTCTCCTCG尖孢镰刀菌Fov1-Eg-rCCCAGGCGTACTTGAAGGAACF．oxysporumFUS1CTTGGTCATGGGCCAGTCAAGAC串珠镰刀菌FUS2CACAGTCACATAGCATTGCTAGCCF．moniliformeVDS-FCACATTCAGTTCAGGAGACG大丽轮枝菌VDS-RCCGAAATACTCCAGTAGAAGGV．dahliae541594386216006052056生工生物工程(上海)有限公司

1.1.5设备与试剂

供试设备主要有：PCR扩增仪(VERITI 2.0)、高速冷冻离心机(AIIegra 25R)、电泳仪(HE99)、凝胶成像系统(G: BOXEF)、紫外透射仪(WD-9403C)等。

供试试剂主要有：琼脂糖、1%的TAE溶液、2000D ladder marker、 2XtapPCR Master mix、ddH20，以及植物总 DNA 提取试剂盒(DP320，由生工生物工程(上海)有限公司提供)

1.2　方 法

1.2.1检测体系建立

1.2.1.1DNA提取

将各供试菌株分别接种于PSA平板培养基上，27℃恒温培养5～12 d后，刮取菌丝约0.3 g放入1.5 mL离心管中，40℃，12 h烘干后，-20℃保存备用；参照的植物总 DNA 提取试剂盒上的操作说明进行菌株DNA提取。

1.2.1.2特异性引物验证

分别使用4种病原菌的引物RSF/RSR、FUS1/FUS2、VDS-F/VDS-R和Fov1-Eg-f/ Fov1-Eg-r对8个供试菌株立枯丝核菌、串珠镰刀菌、大丽轮枝菌、尖孢镰刀菌、链格孢霉(AlternariaAlternata)、茄腐镰刀菌(Fusariumsolani(Mart.) Sacc.)、黑曲霉(Aspergillusniger)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer) 的单一DNA样品、病株总DNA样品、健康植株(CK)的DNA样品进行PCR扩增和电泳分析。根据电泳条带的清晰度及唯一性对上述引物的特异性和适用性进行验证。病株总DNA样品是用预备实验中经单一病原菌接种后获得的病株所制备的DNA样品，用作特异性验证中的阳性对照和田间病株检测效果分析。

1.2.1.3PCR反应体系优化及灵敏度测定

Abd-Elsalam等[5]及赵宗峰等[17]报道的PCR反应体系，利用梯度PCR优化退火温度。

以ddH20稀释菌株DNA至质量终浓度分别为：10、5、2、1、0.5、0.2和0.1 ng/μL，并以无菌水为阴性对照，利用各病原菌对应的引物在不同DNA模板浓度及同上的PCR反应体系中进行PCR扩增和电泳分析，然后根据不同DNA模板浓度下，清晰条带的出现情况进行检测灵敏度分析。

1.2.1.4田间样品检测

从制备的病株混合样品中各取适量(0.3 g)病株碎块分别装入1.5 mL离心管中，提取总DNA (DNA提取方法和步骤同1.7.1)。混合样品的总DAN分别用不同的特异性引物进行PCR扩增及电泳分析，根据电泳中阳性条带出现情况分析各病原菌在各地病样及所有病样中的检出率。

2　结果与分析

2.1　PCR反应体系的优化及检测体系的建立

参考Abd-Elsalam等[5]及赵宗峰等[17]报道的PCR反应体系及反应程序，结合引物合成报告单上提供的相关参数，经改进后建立了研究的PCR反应体系及反应程序。表2，表3

研究表明，RSF/RSR、FUS1/FUS2、VDS-F/VDS-R和Fov1-Eg-f/Fov1-Eg-r 4对引物仅在4种病原菌 [立枯丝核菌(R.solani)、串珠镰刀菌(F.moniliforme)、大丽轮枝菌(V.dahliae)和尖孢镰刀菌(F.oxysporum)] 的DNA样品中分别扩增出约540、1 600、520和438 bp特异性片段，在感病植株阳性DNA样品中也能扩增出与感染菌相应的特异性片段，阴性对照及其它非病原菌菌株和健康植株样品均无任何扩增产物，由此说明，这4对引物具有较强的特异性，且不受寄主DNA的干扰。图1

研究表明，当串珠镰刀菌的DNA模板浓度为0.1 ng/μL以上，其他3种病原菌的DNA模板浓度为0.5 ng/μL以上时，均可以扩增出各自稳定的特异性条带，说明该反应体系下检测灵敏度等于或高于0.5 ng/μL。其灵敏度较高，可用于棉花根茎部病害病原菌的分子检测。图2

表2PCR反应体系
Table2PCR reaction system

25μL反应体系25μLreactionsystem(μL)2xtapPCRMastermix13ddH2O910μmol/L正向引物Forwardprimer10μmol/L110μmol/L反向引物Reverseprimer10μmol/L1植株总DNATotalplantDNA1

表3四种特异性引物的PCR反应程序
Table3PCR reaction program of 4 kinds of specific primer

步骤Step温度Tm(℃)时间Time循环数CycleNumber预变性AninitialDNAmelting953min变性DNAmelting9445s退火AnnealingFOV1-EG-F/FOV1-EG-R621minVDS-F/VDS-R5650sRSF/RSR5945sFUS1/FUS26045s延伸Extension721min32再延伸Finalextension7210min保存Keep4

注：A引物FUS1/FUS2的特异性检测；B引物Fov1-Eg-f / Fov1-Eg-r的特异性检测；C引物VDS-F/VDS-R的特异性检测；D引物RSF/RSR的特异性检测；M：2000D Ladder Maker；1～9：串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、大丽轮枝菌、立枯丝核菌、链格孢霉、茄腐镰刀菌、黑曲霉、匍枝根霉、发病植株混合样品；CK：健康植株DNA(阴性对照)

Note: A: Detect the specificity of primers FUS1/FUS2; B: Detect the specificity of primers FSF/FSR; C: Detect the specificity of primers VDS-F/VDS-R; D: Detect the specificity of primers Fov1-Eg-f/Fov1-Eg-r; M: 2000D Ladder Maker; 1-9:R.solani、F.moniliforme、V.dahliae、F.oxysporum、A.Alternata、F.solani、A.niger、R.stolonifer、Mixed sample; CK: Healthy plant DNA (negative control)

图1四种引物特异性检测结果
Fig.1Detectionresultof4primersspecificity

注：A 立枯丝核菌特异性引物的灵敏度检测；B 串珠镰刀菌特异性引物的灵敏度检测；C 大丽轮枝菌特异性引物的灵敏度检测；D 尖孢镰刀菌特异性引物的灵敏度检测；M：2000D ladder maker；CK：阴性对照；1～7：10、5、2、1、0.5、0.2、0.1 ng/μL

A: Test result ofRhizoctoniasolani; B: Test result ofFusariummoniliforme; C: Test result ofVerticilliumdahliae; D: Test result ofFusariumoxysporum; M: 2000D Ladder Marker; CK: Negative Contro; 1-7: 10、5、2、1、0.5、0.2、0.1 ng/μL

图2四种特异性引物灵敏度检测结果
Fig.2Sensitivity test result of 4 specific primers

2.2　病原菌种类及分布

使用4对特异性引物(RSF/RSR、Fov1-Eg-f/Fov1-Eg-r、VDS-F/VDS-R、FUS1/FUS2)对采自新疆北部棉区的棉花根茎部病害的病样进行的特异性引物PCR分子检测结果显示：在72份以村(连)为单位的棉花根部混合病样中各种病原菌的检出率分别为：尖孢镰刀菌84.72%、立枯丝核菌56.94%、大丽轮枝菌45.83%、串珠镰刀菌37.50%。说明在新疆北部棉花4种根茎部病害病原菌(尖孢镰刀菌、大丽轮枝菌、立枯丝核菌和串珠镰刀菌)皆有其存在和分布，并能侵入棉株引起一定程度的扩展，其中，尖孢镰刀菌和立枯丝核菌为分布较广的优势种。这一结果与前期病害田间调查情况及相关的研究和报道基本吻合[18]。

各病原菌的发生分布情况有较大的差别。其中，尖孢镰刀菌在所有市县级(含附近团场)采样区域的样品中都有较高的检出率，检出率在66.7%～100%，在72个混合病样中有61个被检测到，说明尖孢镰刀菌及所引起的枯萎病在新疆北部的发生分布广泛；立枯丝核菌在所有市县级(含附近团场)采样区域的样品中也都有一定的检出率，但检出率差别较大，在25%～100%，在72个混合病样中有41个被检测到，其中，玛纳斯县(含附近团场)检出率达到100%、博乐市(含附近团场)以及石河子市(含附近团场)检出率都达到80%，而乌苏市的检出率仅为25%，说明立枯丝核菌及所引起的立枯病也有广泛的发生分布，但分布不均，有一定的地域差异；大丽轮枝菌在9个市县级(含附近团场)采样区域中也都有一定的检出率，检出率为8.33%～100%，在72个混合病样中有33个被检测到，其中在博乐市(含附近团场)检出率最高，达到100%，检测出率高于50%的有在精河县(含附近团场)、石河子市(含附近团场)、呼图壁县(含近团场)、玛纳斯县(含附近团场)，而在乌苏市和奎屯市(含附近团场)检出率较低，分别为16.67%和8.33%，说明大丽轮枝菌及所引起的黄萎病在多数市县(含附近团场)分布普遍，而在个别县市(含附近团场)只有少量分布，在其发生分布上也有较强的区域性；串珠镰刀菌在9个采样区域中的7个采样区域能检出，检出率在0～75%，但在沙湾县(含附近团场)检出率最高，到达75%， 石河子市附近团场的检出率次之(53.33%)，而精河县(含附近团场)和博乐市(含附近团场)的检出率为0%，说明串珠镰刀菌及所引起的红腐病分布不广，其分布有更强的地域性，在沙湾县(含附近团场)发生最为集中，石河子市(含附近团场)也有较高频的分布，其他采样区域只有较低频率分布或暂未检测到该菌的分布。

从各市县(含附近团场)的病原菌检出情况来看，在石河子市(含附近团场)、呼图壁县、沙湾县(含附近团场)、昌吉市和玛纳斯县(含附近团场)4种病原菌及所致病害皆有较广的分布；博乐市(含附近团场)和精河县(含附近团场)均未检测到红腐病病原，但其他3种根茎部病害有较广的分布；乌苏市和奎屯市附近团场，虽然4病皆有，但除尖孢镰刀菌及所引起的枯萎病有较广的分布外，其他3种病原菌及所致病害的分布均较窄。表4，图3

表4各采集地棉花4种主要病原菌检测结果
Table4Detection rate of 4 main pathogens of Cotton of each collection

采样地点Collectionplace4种主要病原菌的检出情Detectedsituationof4mainpathogens尖孢镰刀菌F．oxysporum立枯丝核菌R．solani大丽轮枝菌V．dahliae串珠镰刀菌F．moniliforme大西沟镇大西沟村DaxigouVillage，DaxigouTown+---大西沟镇扎哈山村ZahashanVillage，DaxigouTown+---大西沟镇大西沟DaxigouVillage，DaxigouTown-+--四棵树镇索呼仁呼都格SuohurenhudouVillage，SikeshuTown-++-四棵树镇哈勒干布拉格村Haligan-bulageVillage，Sikeshutown+---四棵树镇哈尔莫墩布拉格Haermo-dunbulaVillage，Sikeshutown+---百泉镇浩特浩尔村HaotehaoerVillage，Baiquantown+---百泉镇哈图布呼村HatubuhuVillage，Baiquantown+--+百泉镇喇嘛布愣村LamabulenggeVillage，Baiquantown+++-石桥镇榆树村YushuVillage，Shiqiaotown，+--+石桥镇东梁村DongliangVillage，Shiqiaotown+---石桥镇葫梁村HuliangVillage，ShiqiaoTown---+乌苏市合计检出率ThetotaldetectionrateofWusucity(%)752516．6725茫丁乡小庄子村XiaozhuangziVillag，MangdingTownship+++-茫丁乡夹巴沟村BajiagouVillage，Mangdingtownship+---茫丁乡蘑菇滩村MogutanVillage，MangdingTownship++--八家户农场82团3连No．3company，82Regiment，BajiahuFarm+-+-八家户农场82团6连No．6company，82Regiment，BajiahuFarm+++-八家户农场82团9连No．9company，82Regiment，Bajiahufarm+---精河县及附近团场合计检出率ThetotaldetectionrateofJinghecountyandneartheregiment(%)10050500青得里乡浩特呼尔村HaotehuerVillage，QingdeliTownship+++-90团11连No．11company，90Regiment+++-90团12连No．12company，90Regiment--+-86团5连No．5company，86Regiment+++-89团1连No．1company，89Regiment+++-博乐市及附近团场合计检出率ThetotaldetectionrateofBolecityandandneartheregiment(%)80801000123团7连No．7company，123Regiment++--123团2连No．2company，123Regiment+---123团3连No．3company，123Regiment+---124团6连No．6company，124Regiment+---124团7连No．7company，124Regiment+--+124团3连No．3company，124Regiment-+--

续表

表4各采集地棉花4种主要病原菌检测结果
Table4Detection rate of 4 main pathogens of Cotton of each collection

采样地点Collectionplace4种主要病原菌的检出情Detectedsituationof4mainpathogens尖孢镰刀菌F．oxysporum立枯丝核菌R．solani大丽轮枝菌V．dahliae串珠镰刀菌F．moniliforme126团4连No．4company，126Regiment+---126团2连No．2company，126Regiment++--126团9连No．9company，126Regiment++-+131团6连No．6company，131Regiment---+131团4连No．4company，131Regiment+---131团5连No．5company，131Regiment++++奎屯市附近团场合计检出率ThetotaldetectionrateofneartheregimentofKuituncity(%)83．3341．678．3333．33安集海镇AnjihaiTown++-+四道河子镇SidaoheziTown+--+西戈壁镇XigebiTown+--+大泉乡大泉村DaquanVillage，DaquanTownship+-++大泉乡东泉村DongquanVillage，DaquanTownship++--大泉乡中泉村Zhongquanvillage，DaquanTownship-+++143团19连No．19company，143Regiment++--143团6连No．6company，143Regiment++-+143团21连No．21company，143Regiment+--+144团农6连No．6company，144Regiment+++-144团15连No．15company，144Regiment++++144团3连No．3company，144Regiment+-++沙湾县及附近团场合计检出率ThetotaldetectionrateofShawancountyandneartheregiment(%)91．1658．3341．6775北泉沟村BeiquangouVillage++++石河子乡东桥村DongqiaoVillage，shiheziTownship-+--石河子乡马家坪村MajiapingVillage，ShiheziTownship++++148团6连No．6company，148Regiment+--+148团9连No．9company，148Regiment++++148团3连No．3company，148Regiment++--145团18连No．18company，145Regiment+++-145团11连No．11company，145Regiment++++145团25连No．25company，145Regiment-++-122团2连No．2company，122Regiment++++122团25连No．25company，122Regiment+--+122团15连No．15company，122Regiment+++-133团1连No．1company，133Regiment+++-133团3连No．3company，133Regiment---+133团10连No．10company，133Regiment+++-石河子市及附近团场合计检出率ThetotaldetectionrateofShihezicityandneartheregiment(%)808066．6753．33芳草湖总场TotalField，FangcaohuTown+++-芳草湖农场7连7Campany，FangcaohuTownFarm++++新湖总场1连TotalFieldof1，XinhuTown+-+-新湖四场6连FourFieldof6，XinhuTown+---

续表

表4各采集地棉花4种主要病原菌检测结果
Table4Detection rate of 4 main pathogens of Cotton of each collection

采样地点Collectionplace4种主要病原菌的检出情Detectedsituationof4mainpathogens尖孢镰刀菌F．oxysporum立枯丝核菌R．solani大丽轮枝菌V．dahliae串珠镰刀菌F．moniliforme呼图壁县附近团场合计检出率ThetotaldetectionrateofneartheregimentofHutubicounty(%)100507525六地户镇LiudihuTown-+++北五镇BeiwuTown，+++-150团111连No．111company，150Regiment++--玛纳斯县及及附近团场合计检出率ThetotaldetectionrateofManasicountyandneartheregiment(%)66．6710066．6733．33榆树沟镇前进村QianjinVillage，YushugouTown++--榆树沟镇榆树沟村YushugouVillage，YushugouTown+-+-二六工镇SangonghuVilage，HuyuancunTown++++昌吉市合计检出率ThetotaldetectionrateofChangjicity(%)10066．6766．6733．33总检出率TotalDetectionrate(%)84．7256．9445．8337．5

注：“+”表示检测出该菌；“-”表示未检出该菌

Note: “+” shows that the Pathogen is detected, “-” shows that the Pathogen is not detected

注：A：串珠镰刀菌(F.moniliforme)；B：尖孢镰刀菌(F.oxysporum)；C：立枯丝核菌(R.solani)；D：大丽轮枝菌(V.dahliae)；M：2000D Ladder marker；CK：阳性对照；1～16：混合病样

A:F.moniliforme; B:R.solani; C:F.oxysporum; D:V.dahliae; M: 2000D Ladder marker; CK: positive control; 1-16: Mixed sample

图3部分混合样品中4种病原菌检测情况
Fig.3Detection of 4 pathogens in some mixed samples

3　讨 论

利用4种棉花根茎部病害主要病原菌特异性引物对来自新疆北部的72份棉花根茎部病害混合病样进行特异性引物PCR检测的结果表明：尖孢镰刀菌、大丽轮枝菌、立枯丝核、串珠镰刀菌4种棉花主要根茎部病害病原菌在新疆北部棉花根茎部病害病样均可检出，说明4种病原菌及各自所致病害在新疆北部均有分布；但各病原菌的分布情况有较大的差别，其中尖孢镰刀菌及引起的枯萎病分布最广，立枯丝核菌次之，2种病原菌在新疆北部各采样区域的大多数村(连)都有分布；大丽轮枝菌在各采样区域以及近半数的村(连)都有分布，串珠镰刀菌分布不广，有明显的区域性，仅个别采样区域有较高频的分布。

在病原菌监测及病害分布调查中，传统上采用症状观察及病原菌分离鉴定方法，但这些方法人为因素影响较大，特别是有多种病原菌侵染的根茎部害的调查，容易产生症状上的误判或分离过程中的人为误差。研究采用分子检测方法，能较准确的检测出侵入植物体内的病原菌的存在情况，避免了诸多干扰因素。在一定的灵敏度条件下，只对侵入并有一定的扩展形成较多菌体的病株产生阳性结果，能较好的排除干扰，反应植株体内的实际侵染情况。但在灵敏度不高时易出现漏检的情况，如病原菌侵入不久，只有少数菌丝的时候，可能因检测灵敏度不高而漏检。该文中串珠镰刀菌的检测灵敏度为0.1 ng/μL。而其他3个病原菌的检测灵敏度为0.5 ng/μL。灵敏度较高，其特异性引物检测结果与田间病情调查时观察到的情况较为接近。

4　结 论

通过特异性引物的PCR扩增可以准确地检测出引起棉花根茎部病害的4种致病菌。在新疆北部地区4种病原菌都存在，尖孢镰刀菌、立枯丝核菌和大丽轮枝菌在新疆北部检出率较高，各市县(含附近团场)都有一定的检出率。其中尖孢镰刀菌、立枯丝核菌的检出率高于50%，分布广。而大丽轮枝菌在博乐市和精河县(含附近团场)、呼图壁县和玛纳斯县(含附近团场)有较高的检出率，另在沙湾县(含附近团场)和乌苏市有少数样品被检出，这种检出率的差异可能与地域有关，也可能与采样时间不同有一定的关系(因气候条件和播期不同，采样时苗龄不一致，而4种病原菌的侵染高峰期有一定的差异)。检测结果中串珠镰刀菌在部分地区检出率高，而在另一些地区未检测到，可能与不同地区的的气候条件有密切的关系，因为串珠镰刀菌的孢子萌发要求的湿度86%以上[19]，地下水位高，雨水较多，地表湿度大的地区(如沙湾及附近团场)，有利于串珠镰刀菌的孢子萌发和对棉株的侵染，而地下水位低，雨水较少，地表的湿度小的地区(如精河县及附近团场)，则不利于串珠镰刀菌的孢子萌发和对棉株体内的侵染，从而造成该菌及所致病害在分布上有极为显著的区域性。

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