酮病对围产期奶牛免疫功能影响研究进展

李兰芝，程 茜，苑中策，龙 淼，何剑斌，李 鹏

(沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110866)

随着我国奶牛养殖方式向规模化和集约化饲养的转变，泌乳量不断提高的同时能量需要量也在不断增加，由于分娩后产奶高峰与采食高峰存在时间差异，奶牛能量负平衡(negative energy balance,NEB)的状况增加了近年来酮病的发病率。奶牛发生酮病时，血液中非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acids,NEFA)和β羟基丁酸(β-hydroxybutyrate,BHBA)含量显著升高，造成肝脏功能损伤，引发氧化应激，并会伴随一系列生理代谢的紊乱。这些因素都对奶牛的免疫功能以及繁殖性能造成影响，进而引发其他产后疾病。

奶牛酮病又称奶牛醋酮血症、酮血症，以低血糖和高酮血症为主要特征，是由碳水化合物和脂肪酸代谢障碍引起的奶牛产后全身性功能失调的营养代谢性疾病。常依据有无临床表现分为临床酮病和亚临床酮病。当血清中BHBA的浓度≥3.0 mmol/L时可确定为临床酮病(clinical ketosis,CK)，BHBA的浓度在1.2 mmol/L～2.9 mmol/L时可确定为亚临床酮病(subclinical ketosis,SCK)[1]，并且亚临床酮病被认为是其他代谢和感染性疾病如子宫炎、乳腺炎、临床酮症和皱胃移位的网关条件，且亚临床酮病具有不容易预防和诊断等特点。由于其发病机理复杂，给奶牛养殖业造成严重的经济损失。本文针对酮病对奶牛免疫功能及其机理的影响进行论述，为临床上酮病及其相关产后疾病的防治提供理论基础。

1 酮病对奶牛免疫功能的影响

酮体(主要为BHBA)含量的提升会损害免疫细胞的功能，造成产后的感染增加，奶牛也会呈现抗氧化功能的下降，引发氧化应激，这些都会造成乳房、子宫、蹄部更容易被细菌感染而发生乳腺炎、子宫内膜炎等感染性疾病。在英国、法国、德国、意大利和荷兰的欧洲奶牛场的研究表明，酮病在年轻奶牛中非常普遍，并且与常见的产后疾病，如子宫炎、乳腺炎、牛乳热、跛行、胃肠道疾病和皱胃移位等相关。围产期能量负平衡的压力可导致机体发生严重的脂肪动员，引发循环中NEFA及酮体的过度升高。NEFA浓度的升高可降低机体的免疫力，能够引发多种和免疫相关的炎症反应。

Smith G L等[2]研究发现，产犊后奶牛亚临床酮症增加了奶牛发生皱胃移位、子宫炎、临床酮症、子宫内膜炎、产后首次排卵时间推迟、乳腺炎严重性增加和早期泌乳产量降低等风险。Brodzki P等[3]发现发生子宫炎的母牛在产犊期间循环中性粒细胞中的糖原含量减少，此外，大肠埃希菌刺激的单核细胞中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)的表达也呈下降趋势。有研究表明外周血单核细胞的增殖与血清中NEFA和BHBA的浓度呈负相关，多种免疫细胞功能受NEFA浓度的影响。因此，在围产期奶牛血液中游离脂肪酸浓度的增加可能会导致产后免疫抑制[4]。Hillreiner M等[5]研究发现，血液中BHBA浓度增加可能或至少部分地导致了奶牛在泌乳早期乳腺炎的高敏感性，BHBA的免疫抑制作用可能归因于免疫应答基因的总体抑制，说明长期升高的BHBA浓度，对先天免疫应答具有负面影响。Stefańska B等[6]发现亚临床型瘤胃酸中毒存在于大量具有免疫功能受损的奶牛中。同时，有研究表明，葡萄糖利用性降低和增加的NEFA和BHBA浓度可以通过多种途径损害机体免疫防御机制[7]。

2 酮病影响奶牛免疫功能的机制

2.1 氧化应激

氧化应激是机体内氧化剂作用超过了抗氧化剂作用所导致的氧化剂和抗氧化剂之间的一种不平衡状态。酮病奶牛存在氧化应激，且高NEFA血症和/或BHBA血症可以引发酮病奶牛氧化应激[8]。一些研究证实氧化应激是一个非常重要的潜在因素，特别是在围产期，能够干扰机体的宿主免疫和炎症反应过程，因此增加了奶牛对各种疾病的易感性[9]。Youssef M等[10]研究也表明围产期能量负平衡使得奶牛遭受氧化应激的侵害。

Li Y等[11]研究结果表明，酮病和亚临床酮病奶牛的血浆葡萄糖水平低于非酮病牛，但血浆中NEFA和BHBA浓度较高，此外，还观察到酮症母牛血浆中NEFA和BHBA的浓度与丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)表达水平呈正相关，与总胆固醇(Total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)、极低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein,VLDL)、维生素E水平和羟基自由基能力呈负相关，说明酮病奶牛氧化应激可能与高酮血症和高NEFA浓度有关。免疫细胞含有高浓度的多不饱和脂肪酸，其细胞膜对过氧化反应非常敏感，并且当被刺激时产生大量的活性氧物质，活性氧可引起脂质过氧化，对组织细胞造成破坏。

奶牛发生酮病时，高浓度的NEFA和BHBA积聚在血液中，引起机体酸中毒，破坏机体内环境的稳定，影响肝细胞蛋白及代谢酶的生物学功能，对肝细胞造成“一次损伤”。具有临床酮症的围产期奶牛，脂肪细胞中的BHBA抑制脂肪细胞的体外脂解作用，肝脏中脂肪的显著积累阻碍了代谢并削弱了免疫反应。同时，高浓度的NEFA和BHBA使机体处于氧化应激状态，氧化应激的产物对肝细胞的细胞膜、线粒体膜、蛋白质等造成过氧化损伤，导致肝细胞经历“二次损伤”。这可能是由于脂肪动员和甘油三酯沉积在肝细胞中，导致肝脏损伤和功能障碍。有研究发现，奶牛在围产期处于免疫抑制状态，血浆中较高浓度的3-羟基丁酸直接影响中性粒细胞的功能，发现奶牛产犊后其中性粒细胞释放细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的能力增强，而释放超氧化物阴离子和过氧化氢的能力受到损伤[12]。奶牛产犊后第1周和第2周肝脏甘油三酯(triacyl glycerol,TAG)含量的增加与源自血液和子宫的多形核中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophilic granulocytes,PMN)的功能降低有关，且在高水平TAG条件下，血液中PMN上与功能相关的表面分子表达降低，这可以解释为什么在产犊时脂肪过多(肝脏TAG含量增加)的牛具有较高的传染病发病率。

2.2 对白细胞和中性粒细胞的数量、吞噬功能及趋化功能的影响

白细胞是乳腺组织中对致病微生物感染具有抗性的重要细胞,白细胞的吞噬和趋化性在感染部位的病原体清除中起重要作用。PMN是奶牛乳腺的初级吞噬细胞，是牛乳腺炎感染期间抵抗病原体入侵的第一道防线[13]。PMN是先天免疫反应的主要效应细胞，约占白细胞总量的70%，以吞噬杀菌和炎症反应为主。酮病奶牛的特点是血液中高浓度的NEFA和BHBA，高浓度的NEFA和BHBA参与奶牛PMN免疫功能的调节。

免疫系统在子宫内膜炎发生机制中起着主要作用，在细胞水平上，通过子宫白细胞和PMN对入侵细胞的细菌或污染物进行防御。许多研究表明，大肠埃希菌乳腺炎的严重性主要由牛自身因素而不是由大肠埃希菌致病性决定，在大肠埃希菌乳腺炎期间，宿主防御状态是决定疾病结果的主要因素。我们知道中性粒细胞是奶牛对大肠埃希菌乳房内感染防御的关键因素，通过中性粒细胞有效消除病原体对于解决感染大肠埃希菌乳腺炎是重要的一步。分娩前后奶牛生理状态的变化增加了血液中NEFA和BHBA的浓度，导致白细胞趋化性和吞噬作用降低。Li C等[14]通过人工诱导NEB发现，NEB奶牛血清中皮质醇、血清白蛋白的浓度高于正常奶牛，同时也发现NEB奶牛PMN的吞噬功能和血清淀粉样蛋白A的浓度较正常奶牛低，其结果表明免疫细胞功能可能是葡萄糖依赖性的，进而推测可能是由于产后糖皮质激素分泌的增加而加剧了免疫抑制作用。有研究发现围产期奶牛中性粒细胞和嗜酸性粒细胞数量有减少的现象[15]。

在国内有研究表明，亚临床酮病可导致奶牛循环血液中白细胞、PMN及PMN趋化性和吞噬作用降低。NF-κΒ信号通路是中性粒细胞重要的炎症应答反应机制，张玉明[16]研究表明，酮病奶牛高浓度的NEFA(≥0.5 mmol/L)和BHBA(≥1.2 mmol/L)能够激活NF-κΒ信号通路，促进中性粒细胞炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6的合成和释放，引起奶牛PMN炎性损伤，从而导致酮病奶牛免疫机能低下。

国外研究也证实，随着血液中BHBA浓度的增加(0.1 mmoL/L～8 mmoL/L),PMN对P4型大肠埃希菌的吞噬作用降低了5倍，BHBA导致由P4型大肠埃希菌激活的PMN细胞外诱捕网的形成降低了10倍，并且PMN细胞外诱捕网对该细菌的杀菌活性也相似降低，但是不影响中性粒细胞的细胞内杀菌能力，BHBA对牛中性粒细胞的这些负面影响可能解释了酮症母牛对乳腺炎和其他感染疾病敏感性的增加[17]。虽然其他因素也有可能降低酮病奶牛免疫系统的效率，但酮体可以直接影响中性粒细胞趋化性以及中性粒细胞对胶乳颗粒(1.09 μm)的吞噬作用，所以反刍动物在“酮症综合征”期间感染性疾病的高发病率，也可以用酮体对中性粒细胞功能的影响来解释[18]。

2.3 对淋巴细胞的影响

淋巴细胞也是一种白细胞，由淋巴器官产生，是机体免疫应答功能的重要细胞成分。成熟的淋巴细胞在抗原刺激的分化和增殖中起到其免疫功能。淋巴细胞转化水平可以反映细胞免疫的水平。

在较低葡萄糖浓度下，超生理水平的BHBA抑制淋巴细胞增值，丁酸盐(浓度大于牛血浆中的浓度)和乙酸盐(正常水平)抑制牛淋巴细胞增殖。国内类似研究也表明，亚临床酮病可以导致奶牛循环血液中淋巴细胞数量和淋巴细胞转化率降低。酮体降低了牛淋巴细胞的促有丝分裂反应，BHBA的毒性浓度和亚毒性浓度或乙酰乙酸盐的毒性浓度都显著影响牛淋巴细胞的促有丝分裂反应，当仅用β羟基丁酸酯或乙酰乙酸酯孵育淋巴细胞时，发现有丝分裂应答减少。Meganck V等[19]研究表明，肥育不足的奶牛其初级巨噬细胞数量显著高于正常奶牛，而过度肥育的奶牛具有更多的初级B淋巴细胞，且血清中β-羟基丁酸酯浓度与较高数量的初级T淋巴细胞和巨噬细胞显著相关。

2.4 对外周血免疫球蛋白G及部分细胞因子的影响

2.4.1 对外周血免疫球蛋白G的影响 IgG是血清中免疫球蛋白的主要成分，占血清免疫球蛋白总含量的75%，其在结合补体、增强免疫细胞吞噬病原微生物和中和细菌毒素的能力方面，具有重要作用，能有效地抗感染。

Herr M等[20]发现围产期奶牛血浆中IgG的含量从整体的变化趋势来看，出现了一个先下降，后恢复的过程。奶牛血浆中IgG的含量从产前8周就逐渐开始下降，分娩后2 d～3 d降至最低，直到产后第4周恢复正常水平。但也有研究表明，IgG的含量是从产前第4周开始下降[21]。Hillreiner M等[22]研究发现，高浓度酮体的存在不仅使得PMN的吞噬和杀菌能力降低，而且在酮症牛中观察到细菌感染后细胞因子的产生量下降，以及白细胞的数量和趋化能力受损。

2.4.2 对细胞因子的影响 白细胞介素-2(IL-2)是引导T细胞扩增和表型发育的细胞因子,在伤口愈合中起重要作用，IL-2及其受体可能有助于伤口愈合受损型疾病的治疗[23]。泌乳牛乳房内IL-2和γ干扰素(IFN-γ)可使牛耐受性增强，且IL-2可激活乳中性粒细胞并增强其杀菌活性。Sun Feifei等[24]研究发现，围产期酮症奶牛血浆中IL-2浓度较低，同时，瘤胃保护性蛋氨酸和氯化胆碱可以改善这一情况。

Shi Xiaoxia等[25]研究表明，血清中高浓度的NEFA和BHBA使得奶牛肝细胞中炎性因子IL-6、TNF-α和IL-1β的表达水平升高。Denis-Robichaud J等[26]发现，促炎细胞因子例如IL-6，IL-8和TNF-α可以加速多形核中性粒细胞在感染后浸润到牛子宫内膜中。Zarrin M等[27]发现血浆中BHBA浓度的增加上调了乳腺中的急性期蛋白。Zhang G等[28]研究发现，具有酮症的奶牛血清中有较高浓度的BHBA、IL-6、TNF、血清淀粉样蛋白A和乳酸。

细胞因子如IFN-γ或TNF在产生免疫原性微环境中起关键作用，是抗转移性癌症的关键因素[29]。IFN在免疫后期或小剂量时，对T细胞和B细胞都有促进作用；其还可激活巨噬细胞，增强自然杀伤细胞的活性。血液中酮体浓度的增加抑制了血液白细胞中干扰素的产生，有研究发现，亚临床酮病奶牛血液中细胞因子IFN-γ水平呈现显著下降，IL-2和IL-8也均呈现下降趋势。Sundrum A等[10]用不同浓度的NEFA和BHBA刺激多形核巨噬细胞发现，IFN-γ的分泌量随着NEFA和BHBA的剂量的升高呈线性下降趋势，说明酮病情况下，NEFA和BHBA浓度过高是造成IFN-γ减少的主要因素。

3 展望

综上所述，奶牛发生酮病时，机体氧化应激状态、免疫细胞功能、血液抗体水平以及细胞因子水平均发生显著改变，可能是导致酮病奶牛免疫功能降低，其他围产期疾病患病风险增加的重要因素，但有关酮病对奶牛免疫功能影响的具体机制尚需进一步深入研究。目前对奶牛发生酮病时各器官组织发生炎症反应的程度及差异的研究还较少，缺少针对奶牛酮病时的机体炎症状态、免疫功能的细胞水平和分子水平的检测与鉴定。因此，在分子、细胞和动物水平等不同层面揭示围产期奶牛物质代谢过程及其与免疫功能之间的相互作用关系，尤其是高水平NEFA和BHBA等对奶牛免疫功能的影响及其细胞信号通路，可能是未来研究的热点问题。

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